Covalent binding for robust共价结合

• 共价结合，可实现稳健，可靠，可重复的侧向流动分析

nanoComposix是精密工程和高度特征化纳米粒子制造商。我们的使命是帮助我们的客户将纳米技术产品推向市场。我们的多学科技术团队提供快速原型设计，表征，集成和扩展解决方案，以加速各种应用领域的研发和商业化，包括生物诊断，局部治疗，纳米医学，抗菌涂层和色彩工程。

自2004年以来，nanoComposix已为数千名客户提供单分散和非团聚金属和金属氧化物纳米材料。数百种不同的材料，尺寸，形状和表面可供选择，我们已经生产了2000多种定制的核/壳，生物功能化，荧光和磁性纳米复合材料，以满足客户的要求。NanoComposix生产了NIST纳米银参考材料，我们的颗粒已被用于400多篇同行评审的出版物中。我们所有的材料都提供分析证书，包括电子显微镜，流体动力学直径和每批次的光学数据，以保证产品符合规格。合同制造的规模从小烧杯到数千升不等。用于医疗设备和临床试验的纳米材料在我们的ISO13485和cGMP兼容洁净室设施中生产。通过利用我们*的纳米材料库，我们的目标是帮助客户快速将纳米技术产品从概念转化为商业化。

侧流检测是一种快速、独立的诊断试验，可以检测出各种分析物.该测试价格低廉，携带方便，可在常温下储存，并有很长的货架寿命。 e.该分析提供诊断结果，不需要样品处理或额外设备，使这种格式为理想的护理点和现场诊断。每一个侧面的关键部件 W检验是用分子识别元件(通常是抗体)涂层的检测器粒子。在横向流动检测中常用的一种检测粒子是金纳米粒子wh。 Ich有非常大的吸收截面，使它们在绑定到测试行时易于可视化(参见图1)。制备金共轭探测器粒子的分子识别方法 ENT必须与金颗粒的表面结合。一个创建这些抗体缀合物的方法是简单的混合颗粒的金纳米粒子和抗体结合在一起，使抗体 通过物理吸附与金纳米颗粒表面结合。虽然这通常是成功的，但每一种生理吸附结合都必须根据盐浓度、pH和抗体/部分进行优化。 柱比在某些情况下，抗体与粒子表面的结合较弱，抗体可与表面解离，有可能破坏粒子的稳定或降低pa。 质膜对分析物的结合亲和力。另一种将抗体与粒子表面结合的方法是使用共价化学。共价结合提供了许多优点 clouding暗晦，湿润，

在更大范围的样本矩阵中增加共轭稳定性

对粒子/抗体比率的更大控制

减少寻找适合抗体对所需的共轭反应次数

本白pi书提供了关于如何通过共价结合形成健壮和可靠的抗体结合的附加信息。

共价结合粒子

纳米复合物为共价结合提供了三种不同的生物制备纳米粒子：40 nm直径的金纳米球，80 nm直径的金纳米球和150 nm直径的金纳米。粒子Ar E功能化的脂聚乙二醇酸(用于纳米球)或硫辛酸(用于纳米)，以产生一个强大的羧基表面，共价结合在选定的靶向剂上的游离胺。共价 酰胺键之间的羧基和自由胺是通过EDC/Sulfo-NHS中间实现的(图2)。对于抗体来说，赖氨酸残基是EDC/NHS结合的主要靶位点。一个 典型IgG抗体有80~100个赖氨酸残基，其中30~40个可与EDC/NHS结合。蛋白质，如牛血清白蛋白，有相似数量的可接近赖氨酸基团。 .

在共轭之前，抗体溶液在储存缓冲液中不含有额外的游离胺是至关重要的，因为游离胺将与纳米粒子上的结合位点竞争。f Ree胺，包括在Tris缓冲液或防腐剂sodium azide;  中发现的，必须除去，抗体必须转移到合适的氨基缓冲液中。一种常见的执行此操作的方法 洗涤步骤是使用自旋列(图3)。此外，抗体溶液中的任何附加稳定蛋白也必须去除。蛋白质A或其他亲和柱可用于 其他蛋白质的抗体。蛋白质纯化应该首先进行，因为从亲和柱中洗脱抗体通常需要使用含有胺的缓冲液。潜艇 然后需要将抗体依次纯化成无胺缓冲液.抗体纯化的步骤详见下文。

材料( material的名词复数 )

微孔超0.5mL 10K蛋白质纯化和浓缩过滤器(目录#UFC 5096)

2毫升微离心管可容纳过滤器

微型离心机

需纯化的抗体(例如，每个过滤器的抗体为0.1至2毫克)

·纯化缓冲液(例如10毫米磷酸钾或其他无胺缓冲液)

蛋白质定量用bca检测试剂盒和平板阅读器或紫外-可见分光度计

净化协议

在微离心管内放置过滤器。

加入450升纯化缓冲液，在13.8K RCF离心5分钟，预冲洗滤池。

将滤液处理到管子底部。

ALI抗体溶液进入过滤器并关闭盖子。该过滤器可容纳500微升，如果净化体积超过这一能力，离心机浓缩和添加更多的未纯化抗体之前。 继续清洗步骤。如果初始抗体量小，则加入缓冲液，可达~450μL的总体积。

用13.8K RCF离心5分钟浓缩。

从微离心管中取出含有浓缩抗体的过滤器。从微离心管底部取出滤液。

注：滤液可从清洁容器内的所有洗涤步骤中保留下来。如果由于穿透滤池而产率特别低，则可从保留的滤液中回收抗体。

将含有浓缩抗体的过滤器放回试管中，并在滤池中加入350毫升的纯化缓冲液。

在13.8K RCF离心5分钟，洗涤/浓缩。

重复洗涤程序(步骤5-7)，再用350毫升的额外净化缓冲液洗涤四次，共洗涤五次。

后一次清洗后，将设备倒转到一个新的，清洗2毫升微离心管，并切断盖子。在1k RCF离心5 min，收集纯化和浓缩抗体。奥普提 Mal恢复，立即进行反向旋转。

将抗体溶液后浓度为≥1mg/mL保存。纯化后，典型的推荐储存方法是将纯化的抗体≥1 mg/mL保存在蚂蚁的基础上。 供应商的分析证明。一般来说，应避免冻结/解冻循环。关于建议的储存和处理程序，请参考抗体供应商的说明。

确定终蛋白质浓度

现在你已经纯化了你的抗体，确定终的蛋白质浓度是很重要的。这可以通过一种基于SPECT中280 nm处溶液吸光度的方法来实现。 分光度法(A 280法)或二异氰酸酯(BCA)法。

1. 大样本回收率

2. 精矿中样品回收率低可能是由于吸附损失、浓度过高或样品通过膜造成的。若要大限度地提高样品回收率，请确保吸管针尖不起作用。 他没有刺破滤膜。吸附损失取决于溶质浓度、疏水性、温度、与过滤装置表面的接触时间、样品组成和pH值。到 尽量减少损失，离心后立即取出浓缩样品。如果起始样品浓度较高，请监测离心过程，以避免过浓。 样本。过量的浓度会导致沉淀和潜在的样品损失.如果样品似乎通过膜，选择一个较低的名义相对分子质量限制(NMWL)amico。 n超-0.5滤波器单元。收集浓缩/纯化抗体后，可用少量纯化缓冲液冲洗滤池内几次，回收任何抗体t。 帽子可能在滤膜上。

3. 结合协议：步骤2：抗体结合

4. 抗体可以通过碳二亚胺交联化学(EDC)与纳米颗粒表面的端羧基结合。EDC与羧酸基团反应 形成活性酯中间体。磺化NHS的加入提高了中间体的溶解度和稳定性，该中间体与抗体的胺基团发生反应，形成稳定的酰胺键Be。 抗体和纳米粒子之间。下面的方法描述了羧基功能化纳米粒子的抗体结合步骤。

5. 所需材料

6. 40 nm直径生物制备羧基金纳米粒子

7. 不加任何游离胺的纯化抗体

8. 反应缓冲液(5毫米磷酸钾，0.5%20 KmW PEG，pH 7.4)

9. European Defence Community欧洲防务集团

10. 羟基硫代琥珀酰亚胺

11. 猝灭剂（50%（W/V）羟胺）

12. 共轭稀释剂(0.1x PBS，0.5%BSA)

13. 离心机

14. 标准微离心管(没有特殊处理或残留增塑剂)

15. [航]涡流

16. 旋转者，转动体

17. 共轭协议

18. 提出了40 nm直径羧基金纳米粒子在OD 20处1mL的共轭策略，在OD 20处产生1mL的抗体-金共轭物。适用于较大或较小的体积 MES，比例按比例或遵循特定的共轭协议提供的每个生物反应的羧基变体。

19. 重要事项：步骤1-6应在溶解EDC/Sulfo-NHS后立即完成，以尽量减少Sulfo-NHS酯在水中的水解，并提高共轭效果。

20. 在接枝前用10 mg/mL的H2O制备EDC和Sulfo-NHS。

21. 小贴士：确保EDC和磺胺类NHS试剂在打开小瓶前保持室温。在每个微离心管中分别称重1-10毫克EDC和磺基NHS。就在前面 在适当体积的H2O中溶解，使其浓度达到10 mg/mL。

22. 例子：EDC质量=2.38mg，添加238 LH2O质量为Sulfo-NHS=6.14毫克，添加614升H2O

23. 在40 nm羧基金纳米粒子的1mL中加入200μg的EDC(20 L新鲜制备的EDC，在H2O中10 mg/mL)和400 g的Sulfo-NHS(40 L的新制备的Sulfo-NHS，在H2O中浓度为10 mg/mL)。

24. 漩涡溶液在室温下旋转30分钟

25. 在3600 RCF离心10分钟。

26. 小心移除上清液，去除任何过量的EDC/Sulfo-NHS，并在1mL反应缓冲液中重新悬浮。旋涡和(或)声波使粒子*重新悬浮。

27. 加入抗体和漩涡溶液。

28. 旋转时，在室温下孵育2小时。请注意，较短或较长的孵育时间可能会提高结合的效果。

29. 孵化后，添加10升昆彻，以使任何剩余的NHS-酯类物质失活.旋转时，在室温下旋转10分钟。

30. 在3600 RCF离心10分钟。小心去除上清液，并在1mL反应缓冲液中重新悬浮.旋涡和/或声纳以*重新悬浮共轭。

31. 重复离心和再悬浮以去除多余的抗体。

32. 再在3600 RCF离心10分钟，取出上清液，用共轭稀释剂使体积达到1mL。旋涡和/或声纳以*重新悬浮共轭。

33. 在4°C保存共轭物，不要冻结。

优化共轭的附加提示

需要注意的是，宜的结合步骤是依赖于抗体的，并且抗体之间的优化技术会有所不同。共轭物在溶液中应该是稳定的，并且 与抗原有效而特异的结合。以下提示可以提高共轭的效率：

在pH值为5的条件下，EDC和Sulfo-NHS对羧酸基团的活化效果适。

当pH值为7~7.5时，伯胺对抗体与活性羧基发生反应的pH值高。在较高的pH值下进行反应，大大降低了.的半衰期。 NHS-酯中间体。

结合过程中抗体的浓度和抗体与纳米粒子的孵育时间可进行调节，以确定宜条件。

共轭稀释剂组分可以调整，以确定宜缓冲摩尔度，pH，阻滞剂，聚合物和表面活性剂。

共轭协议：步骤3：描述共轭

对共轭物的表征对于确保抗体结合在粒子表面和共轭物是稳定的是至关重要的。紫外可见光谱仪是一种可以利用的工具。 ED通过观察等离子体共振吸收来评价其稳定性。纳米粒子在共轭前后的共振峰位置有轻微的变化，表明抗体具有 成功地与表面结合。如果共轭物聚集，峰移并变得更宽（图4）。动态光散射是另一种可用于筛选SMA的工具。 通过测定流体力学尺寸和多分散性指数，得到聚集量。横向流动试验条也是评价共轭性能的一种有效方法，同时也是一种辅助手段。 申请这样的结合。侧流测试条可以含有与纳米颗粒结合的抗体的特异性试剂，并提供了一种快速、简便的检测方法。 研究抗体是否成功结合并保持功能。

批量大小和每条带钢的价格

生物制备羧基粒子是在纳米复合材料的ISO 13485符合质量体系，确保高批号-批次一致性的粒子性质。地段大小可达400，000 OD-MLS( 相当于1 OD金400 L)，单批可产生约1，000，000条。在供应合同中，客户可以保留特定的批次，以便在一年内从同一批中取样。 ，在切换到新批次时，由于重新优化而减少任何停机时间。大量生产也使我们能够以竞争力的价格提供具有广泛特色的产品。什么时候 比较供应商定价，重要的是要调整为不同数量和不同浓度供应的价格。为了规范定价，我们通常用OD-mL来讨论成本。 简单的价格除以产品的OD溶液和体积。例如，如果在10 OD浓度下，100 mL体积的金纳米粒子的成本为600美元，那么每OD-mL的成本为600美元。 /(100*10)=0.60美元。与其他许多供应商不同，我们的共价耦合解决方案具有*的成本效益，终成本仅略高于物理吸附产品的成本。 离子。当您考虑到开发时间更快、在各种样品介质中更稳定、每个粒子的抗体使用量更低、以及更好地控制抗体/粒子的优点时， e比率，在许多情况下，使用共价结合可以降低净成本和提高性能。

请随时与我们的销售人员联系，提供报价或获得更多的共价绑定帮助。

结论

我们的生物准备羧基金是一种简单和成本效益的方法，以创造敏感，稳健和可靠的金共轭物。我们有许多客户无法做出稳定的共轭w。 被动吸附，但与共价结合成功。在竞争性横向流动测试中，颗粒表面的抗体数量对于调节动力至关重要。 C值范围内，共价结合增加了对颗粒/抗体比值的控制。由于共价结合比被动吸附更有效，抗体量的减少 当使用昂贵的抗体时，需要建立一个测试可以导致化验成本的净减少。在我们手中，共价结合的优点是快速清除抗体PAI的能力。 由于不再需要扫描每个纳米粒子共轭物的盐和pH，因此标准的EDC/NHS结合条件通常是次起作用。如果你还没试过Coval 目前还没有绑定，请与我们联系，以帮助粒子选择和绑定化学协议和支持。

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