Cytoskeleton，Inc.成立于1993年。自成立以来，我们一直在不断扩大产品范围。

Cytoskeleton，Inc.很高兴为药物筛选，信号转导和细胞骨架研究提供广泛的试剂盒和产品。我们专注于纯化蛋白的生产和易于使用的试剂盒，以研究生化和细胞过程。我们的试剂盒既可用于基础研究或小型筛查的少量样品（Biochem Kits™），也可用于大型筛查的高通量规模（CytoDYNAMIX Screens™）。

除了我们现有的产品，我们还提供产品系列中微管，微管蛋白，运动蛋白，小G蛋白效应物，GAP，GEF和其他几种蛋白的药物筛选服务。

cytoskeleton BK033-S说明书

Arf6 Pull-down Activation Assay Biochem Kit (bead pull-down format) - 20 Assays

Amount

20 assays  (Cat. # BK033-S)

产品用途包括

• 分析体内 ARF6激活。
   

介绍

与Ras相关的小G蛋白的哺乳动物ADP核糖基化因子（Arf）亚家族初被命名为具有刺激霍乱毒素介导 的许多GPCR使用的_Gsα亚基的ADP核糖基化的能力（1）。根据其大小和氨基酸相似性，将Arf GTPases分为三类：I类（Arf6和Arf3），II类（Arf4和Arf5）和III类（Arf6）。Arf6的主要作用之一是蛋白质从质膜转运到内吞区室（例如GPCR），并且似乎在某些GPCR的顺行转运中起作用（3、4）。像Arf1一样，Arf6部分地通过脂质修饰酶的激活来改变局部膜环境（3）。

与其他小G蛋白一样，Arf6在无效的GDP结合状态和有效的GTP结合状态之间循环。效应蛋白与GTP结合的Arf6与GDP结合的状态的优先结合为Arf6在细胞中的功能提供了基础。效应蛋白与Arf6-GTP的这种高度特异性的联系已被用于开发亲和沉淀测定法以监测Arf6的活化（5）。

细胞骨架的Arf6活化检测法Biochem Kit™利用效应蛋白GGA3（含有高尔基体的γ-耳，含有Arf结合蛋白3）的Arf6蛋白结合域（PBD），该蛋白已被证明与GTP结合形式Arf6（5，6）。我们已经在大肠杆菌中共价结合了纯化的GGA3-PBD（氨基酸1-316）试剂盒中提供的彩色琼脂糖珠（图1）。使用这些珠子，研究人员能够使用该试剂盒中提供的Arf6特异性抗体，“下拉” Arf6-GTP并定量活性Arf6的水平，随后进行蛋白质印迹步骤。该测定法提供了一种分析各种系统中细胞Arf6激活水平的简单方法。下面的图2显示了典型的Arf6下拉测定法，使用的是GTPγS和GDP负载的MDCK细胞提取物，或已经收获并保持悬浮状态或铺在纤连蛋白包被的培养皿中的MDCK细胞提取物（例如，参见参考文献7， 8）。

试剂盒内容
试剂盒包含足够的材料，可用于20种测定，具体取决于测定的设置，并包括用于阳性和阴性对照的试剂。包括以下组件：

1. GGA3-PBD磁珠（目录号GGA05）
2. Arf6单克隆抗体（目录号ARF06）
3. His标记的Arf6蛋白
4. GTPγS：（不可水解的GTP类似物）（目录号BS01）
5. 国内生产总值
6. 细胞裂解液
7. 洗涤缓冲液
8. 加载缓冲
9. 停止缓冲区
10. 蛋白酶抑制剂混合物（目录号PIC02）
11. 二甲基亚砜
12. 带有详细协议的手册和详尽的故障排除指南

结果示例

图2显示了典型的Arf6下拉测定法，使用的是GTPγS和GDP负载的MDCK细胞提取物，或者是已收获并保持悬浮状态或铺在纤连蛋白包被的培养皿上的MDCK细胞提取物（例如，参见参考文献7、8 ）。
 

图2.  Arf6激活测定Biochem Kit™下拉测定结果。
 

上：  使用产品手册第VI节：对照反应中所述的方法，将装有GTPγS（GTP泳道）或GDP（GDP泳道）的MDCK细胞裂解液（500 µg）装满。  

底部：  从悬液中悬浮2小时（Sus）或在组织培养板（Rp）上生长的细胞获得的MDCK细胞裂解物（500 ug）。所有提取物均与20μgGGA3-PBD珠一起孵育，并按照产品手册第VI节：Pulldown分析中所述进行处理。将所有珠子样品重悬于20 µl 2x样品缓冲液中，然后在4-20％SDS-PAGE凝胶上分离，转移至PVDF，以1：250稀释的抗Arf6抗体进行探测，并按照所述方法进行化学发光检测在产品手册的第六节：STEP 4中。

参考文献

1. Kahn，RA，和Gilman，AG（1986），霍乱毒素对Gs进行ADP-核糖基化的蛋白质辅因子本身就是GTP结合蛋白。J.Biol。化学 261，7906-7911。
2. Tsuchiya，M.，Price，SR，Tsai，SC，Moss，J。和Vaughan，M。（1991）ADP-核糖基化因子mRNA的分子鉴定及其在哺乳动物细胞中的表达。J.Biol。化学 266，2772-2777。
3. D'Souza-Schorey，C.和Chavrier，P.（2006）ARF蛋白：在膜运输及其他方面的作用。纳特 牧师 细胞生物学。7，347-358。
4. Wang，G.和Wu，G.（2012）GPCR顺行贩运的小GTPase调控。趋势药理学。科学 33，28-34。
5. Cohen，LA和Donaldson，JG（2010）分析Arf GTP结合蛋白在细胞中的功能。Curr。协议。细胞生物学。48，14.12.1-14.12.17。
6. Takatsu，H.，Yoshino，K.，Toda，K.和Nakayama，K.（2002）GGA蛋白通过其GGAH结构域和ADPribosylation因子之间的相互作用与高尔基膜结合。 生化。J.  365，369-378。
7. Balasubramanian，N.，Scott，DW，Castle，JD，Casanova，JE和Schwartz，M.A.（2007）Arf6和微管在脂筏的黏附依赖性转运中。纳特 细胞生物学。9，1381-1391。
8. Goldfinger，LE，Ptak，C.，Jeffery，ED，Shabanowitz，J.，Hunt，DF，和Ginsberg，MH（2006）RLIP76（RalBP1）是一种R-Ras效应子，介导粘附依赖性Rac活化和细胞迁移。J.细胞生物学。174，877-888。