| PGX-CYP2C19StripAssay® |  | 4-750 |
1. Lysis Solution 50 ml
2. GENXTRACT Resin 5 ml
Resuspend each time immediately before removing an aliquot.
3. Amplification Mix (yellow cap) 500 µl
4. Taq Dilution Buffer (transparent cap) 500 µl
5. DNAT (blue cap) 1.5 ml R 36/38
6. Typing Trays 3
7. Teststrips 20
8. Hybridization Buffer (white cap) 25 ml
9. Wash Solution A (white cap) 80 ml
10. Conjugate Solution 25 ml
11. Wash Solution B 80 ml
12. Color Developer 25 ml
使用说明
一、预期用途
基于聚合酶的细胞色素（cyp）2c19基因突变检测
链式反应和反向杂交。
二。方法
这个过程包括三个步骤：（1）DNA分离，（2）生物素化PCR扩增
引物，（3）扩增产物与含有等位基因特异性的试纸条杂交
寡核苷酸探针固定成平行线阵列（图1）。结合生物素
用链霉亲和素碱性磷酸酶和彩色底物检测序列。
该方法包括8个多态位点：c.681g>a（2c19*2），c.636g>a（2c19*3），c.1a>g。
（2c19*4），c.1297c>t（2c19*5），c.395g>a（2c19*6），c.819+2t>a（2c19*7），c.358t>c
（2C19*8），C.-806C>T（2C19*17）。
更多的遗传信息可在OMIM在线孟德尔人类遗传：
www.ncbi.nlm.nih.gov/omim
三、套件组件
见一页所有组件清单。
脱氧核糖核酸含1.6%氢氧化钠（r 36/38）。
放大混合物，TAQ稀释缓冲液，共轭溶液，洗涤液B含0.05%
奶奶3。结合液中含有链霉亲和素碱性磷酸酶。彩色显影剂
含有硝基蓝四唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）。
不使用时，将所有试剂储存在2-8°C！
四、需要但未提供的材料
除了标准分子生物学实验室设备外，还需要以下设备：
•可调微型离心机，转速3000-12000转/分（1000-12000 x g）
•培养箱（例如加热块、水浴），温度分别为56°C和98°C（±2°C）
•热循环器和合适的薄壁塑料反应管/带
•TAQ DNA聚合酶
•带振动台和可调温度的水浴槽（45°C±0.5°C）
•真空抽吸装置
•振动筛（摇杆或轨道振动筛）
•可选：琼脂糖凝胶电泳设备（用于扩增产物的控制）
分析程序
一。DNA分离
新鲜或冷冻的血液中加入edta或柠檬酸抗凝剂；避免血液中含有肝素。
在室温下储存血液的时间不得超过3天，在2-8°C下储存血液的时间不得超过1周
使用前。冷冻一年以上，或经历多次
三次以上的冻融循环不适合用于此程序。
把血样带到室温。小心倒置采血管，充分混合
好几次。每次取血前重复混合。
使裂解液和genxtract树脂达到室温。
•用带螺帽的1.5毫升微管吸取100微升血液样本。
•加入1毫升裂解液，合上试管，倒置数次混合。
•室温下静置15分钟。
•在微型离心机中以3000转/分（约1000 x g）离心5分钟。
•取下并丢弃上层（顶部）1毫升上清液。
•加入1毫升裂解液，合上试管，倒置数次混合。
•在微型离心机中以12000转/分（约12000 x g）离心5分钟。
•除去并丢弃上清液，但约50微升可见的软颗粒除外。
•*旋转瓶子，重新使用Genxtract树脂。
•向颗粒中添加200微升Genxtract树脂。关闭管和涡流10秒。
树脂沉积迅速。每次立即重复再悬浮
在移除另一个等份之前。
•在56°C下孵育20分钟，涡流10秒。
•在98°C下孵育10分钟，涡流10秒。
•在微型离心机中以12000转/分离心5分钟。冰上凉快。
所得到的上清液含有适于在pcr中立即使用的dna模板。为了
进一步储存时，上清液应转移到新鲜的试管中并保持冷藏。
（2-8°C；多一周）或冷冻在-20°C。
2.体外扩增（PCR）
将所有PCR试剂和DNA模板冷藏。执行所有步骤直到开始
冰上热循环程序（0-4°C）。
•在TAQ稀释缓冲液中制备新的TAQ DNA聚合酶工作稀释液（0.2 U/微升）
（透明盖）。
•为每个待放大的样品准备一个反应管。把管子放在冰上。
•对于每个样品，在冰上制备终PCR反应混合物：
15微升放大混合物（黄盖）
5微升稀释TAQ DNA聚合酶（1U）
5微升DNA模板
如果使用的DNA模板不是由试剂盒分离协议（第V/1章）制备的，则
建议浓度范围为5-40微克/毫升（=每个反应25-200纳克DNA）。
把管子盖紧。将热循环器预热至94°C。
•插入反应管并运行以下热循环程序：
预PCR:94°C/2分钟。
热循环：94°C/15秒。-58摄氏度/30秒。-72摄氏度/30秒。（35个循环）
终延伸：72°C/3分钟。
将放大产品存放在冰上或2-8°C下，以备进一步使用。
可选：用凝胶电泳分析扩增产物（如3%琼脂糖凝胶）。
片段长度：288254218182161146bp
三。杂交（45°C；振荡水浴）
将水盆的水位调整到打字托盘高度的约1/2。
将水浴加热至45°C（±0.5°C）。用校准过的
温度计。
预热杂交缓冲液并将溶液A洗涤至45℃（注意所有沉淀
在2-8°C下形成，*溶解。）
使试纸、DNAT、共轭溶液、洗涤溶液B和显色剂达到
室温。准备打字托盘。
使用干净的镊子为每个样品取下一个测试条。（用手套触摸测试条
只有！）用铅笔在标记线外标记测试条。（没有圆珠笔，马克笔，
等）
•将10微升DNAT（蓝帽）吸管插入每个通道的下角，用于打字
托盘（每个样品一条通道）。
•将10微升扩增产物加入相应的DNA滴中。
用吸管*混合。（解决方案将保持蓝色。）
•室温下静置5分钟。
•在每个通道中加入1毫升杂交缓冲液（预热至45°C）。
轻轻搅动托盘。（蓝色将消失。）
•插入带有标记的测试条（可见线条！）进入各自的车道。潜入
*。
•在水浴的摇床上，在45°C下培养30分钟。
设置适当的震动频率（约50转/分）以避免溢出。保持
水盆关闭以避免温度变化。
•孵化结束时，通过真空抽吸去除杂交溶液。
立即进行。在整个过程中，不要让测试条干运行。
四。严格清洗（45°C；摇晃水浴）
•加入1毫升洗涤液A（预热至45°C）。短暂冲洗（10秒）。
通过真空抽吸除去液体。
•加入1毫升洗涤液A（45°C）。
•在45°C的摇动水浴中培养15分钟。
通过真空抽吸除去液体。
•加入1毫升洗涤液A（45°C）。
•在45°C的摇动水浴中培养15分钟。
通过真空抽吸除去液体。
5个。显色（室温）
•加入1毫升共轭溶液。
•室温下在摇床或轨道振动筛上培养15分钟。
通过真空抽吸除去液体。
•加入1毫升洗涤液B。短暂冲洗（10秒）。
通过真空抽吸除去液体。
•加入1毫升洗涤液B。
•室温下在摇床或轨道振动筛上培养5分钟。
通过真空抽吸除去液体。
•加入1毫升洗涤液B。
•室温下在摇床或轨道振动筛上培养5分钟。
通过真空抽吸除去液体。
•加入1毫升显色剂。
•在室温下，在摇床或轨道振动筛上黑暗中培养15分钟。
阳性反应出现紫色染色。
•用蒸馏水清洗测试条数次。
在暗处用吸水纸把纸条晾干。
颜色显影后，不要将试纸置于强光下。
六、结果解释
样本的基因型是用所附的collectorTM表确定的。
将处理过的测试条放入字段之一，将其与示意图对齐
使用红色标记线（顶部）和绿色标记线（底部）绘制，并用
胶带。
上面控制线的正反应表示共轭的正确函数
溶液和显色剂。这条线应该总是染色阳性。
对于每个多态性位置，应获得以下染色模式之一：
注意：阳性线的染色强度可能不同。这对结果没有意义。
