ibex 60-1003-001说明书
PROCOLLAGEN II C-PROPEPTIDE ELISA ITEM #60-1003-001 (CP II ELISA)
前胶原ⅡC-丙肽酶联免疫吸附试验
1.1程序原则
本试验测量新合成的前胶原释放到基质中后从II型前胶原中裂解的II型胶原羧基丙肽（C-丙肽，本文也称为CP II）。
本试验仅用于体外研究，已优化用于分析人血清，但也用于分析各种类型的样品和物种。它仅用于比较分析，不用于诊断目的。所有样品必须以推荐的方式进行处理。
1.2分析原理
本试验是一种96孔竞争性免疫试验，利用预先包被在ELISA板上的牛CP-II抗原。将牛CP II标准和未知样品添加到聚丙烯混合板中，然后用兔多克隆抗血清特异于CP II。将该混合物预孵育以允许抗体与游离CP-II抗原结合。然后将预孵育的样品从聚丙烯混合板转移到CP II ELISA板上，并孵育以使抗体结合到固定在板上的CPII、CP II标准或血清样品中的内源性表位。洗涤后的CPII酶联免疫吸附试验板，加入共轭山羊抗兔辣根过氧化物酶（GARHRP），它结合在板上的任何兔抗体。再次清洗CPII-ELISA板后，
将四甲基联苯胺底物（TMB）加入到与HRP反应生成蓝色产物的各孔中。
停止反应并用酸放大信号，酸将产物从蓝色转化为黄色，可在450 nm处定量。450nm处的光密度（OD）与
与样品中新表位的数量成正比。1.3背景
透明软骨是由一个细胞外基质，主要含有II型胶原原纤维和一个大的聚集蛋白聚糖称为聚集蛋白聚糖。关节炎时，胶原基质破坏，蛋白多糖含量降低。
基质成分的这种变化涉及基质胶原过度降解和通过提取CPII揭示的胶原合成的变化（Squires等人2003年；Aurich等人。2005年）。
II型胶原是一种前胶原，含有氨基和羧基丙烯肽。当胶原与胶原原纤维结合时，这些被氨基和羧基蛋白酶从细胞外去除。丙肽的半衰期约为18小时（Nelson等人。。CP II含量与II型胶原合成直接相关（Nelson等人。1998年）。
膝关节损伤后滑液和原发性OA中CP-II含量增加（Lohmander等。1996年）
和OA血清减少（Nelson等人。。单独使用或与其他胶原蛋白一起使用时
降解生物标志物，可用于鉴别放射学前和已建立的膝关节OA与no
OA（Cibere等人。2009），OA进展（Cahue等人。以及识别hip OA的子集（Conrozier
等。2007年；2008年）。血清RA中的CPII升高（Nelson等人。1998年；Mansson等人。1995年）并且可以使用
用胶原降解标志物检测早期（1个月）对放射治疗的反应
1岁时进展（Mullan等人。2007年）。
2。协议
使用前，将CP-II ELISA试剂盒置于室温（20-25°C）至少30分钟。在协议的所有步骤中都要戴手套。
注1：打开前轻轻离心微管，以确保试剂的正确回收。
注2：试剂和样品在使用前必须轻轻旋转。
根据表1制定标准。注：CP II与玻璃结合；在聚丙烯管中构成CP II标准。
在聚丙烯混合板上加入50μl的CPⅡ标准和样品。血清样品应使用缓冲液III稀释1/2。可直接在平板上稀释（25微升血清+25微升缓冲液III）。
将50μL的CPⅡ抗体稀释至缓冲液中，加入聚丙烯共混板的所有威尔斯中。（一个平板：50微升CP II抗体+6毫升检测缓冲液）。
在室温下（20-25℃），在700±10转/分钟的高速微孔板振动筛上预涂聚丙烯共混板，时间为60分钟（2分钟）。
从箔袋中取出CP II酶联免疫吸附试验板。使用多通道吸管将聚丙烯混合板的每个孔中的抗原抗体混合物的80μL转移到ELISA板的相应威尔斯。
在室温（20-25°C）下，将覆盖的酶联免疫吸附试验板在700±10转/分的高速微孔板振动筛上培养2小时（±2分钟）。
用350微升/稀释好的洗涤缓冲液（1倍）洗涤酶联免疫吸附测定板6次，无浸泡时间。后一次清洗后，用吸水纸吸干盘子。
添加100微升/孔在缓冲液III中稀释的GAR-HRP共轭物。
（一个平板：50微升GAR-HRP/11毫升缓冲液III）。
在室温（20-25°C）下，以700±10转/分的转速将覆盖的酶联免疫吸附试验板在高速微板振动筛上培养30分钟（±2分钟）。
用350微升/稀释好的洗涤缓冲液（1倍）洗涤酶联免疫吸附测定板6次，无浸泡时间。后一次清洗后，用吸水纸吸干盘子。
添加100微升/井TMB。
在室温（20-25°C）下，以700±10转/分的速度将覆盖的酶联免疫吸附试验板在高速微板振动筛上培养30分钟。加入100微升/孔的
停止解决方案。
读取450 nm处的平板吸光度，宜在10分钟内将参考波长设置为630 nm。
3、设备和材料
所需材料-未提供
去离子水
用于制备洗涤液的量筒
精密移液管，提供20–1000微升的一次性针头
精密多通道吸管，提供100微升的一次性针头
涡流混合器
轨道式微型平板振动筛，每分钟转速700转（转/分）
自动微孔板清洗机
双波长读数450 nm和630 nm的微量滴定板阅读器（参考滤光片：590-650 nm）
能够计算适合数据分析的4或5参数曲线的软件。供应的材料（除非标签上另有说明，否则所有试剂应在2-8°C下储存，直至到期日。）
·CP II酶联免疫吸附试验板。在含有牛血清白蛋白的稳定基质中包被纯化牛CP-II的ELISA板。用带干燥剂的小袋包装。
聚丙烯共混板。
牛CP II标准储备（10微克/毫升）。从缓冲液III中提取7个标准品（标准品：0、50、100、250、500、1000和2000 ng/mL）。CP II抗体。在含有BSA和非汞防腐剂的蛋白质缓冲液中稀释的兔抗CP-II原代多克隆抗体。
分析缓冲液。含有牛血清白蛋白、山羊正常血清和无汞防腐剂的蛋白质缓冲液。用于稀释原始抗体。
缓冲液III.含有BSA和非汞防腐剂的蛋白质缓冲液。用于稀释标准品、样品和二级抗体。
GAR-HRP共轭物。含有牛血清白蛋白和非汞防腐剂的蛋白质缓冲液中的二级抗体。
清洗缓冲液（25倍）。含有带非离子洗涤剂的缓冲盐水。根据需要在去离子水中稀释制备洗涤缓冲液。例如，对于1000毫升洗涤缓冲液，取40毫升浓缩洗涤缓冲液（25倍），用去离子水补充至1000毫升。洗涤液不含防腐剂。稀释后在2-8°C下保存不超过一周。
·TMB。在缓冲液中使用的四甲基联苯胺（TMB）溶液。。
停止解决方案。准备使用0.2 M硫酸。
程序说明
为了获得可靠的结果，必须遵循以下建议：
收集样本，在-70°C下冷冻，如果适用，同时运行所有时间点（详情请参阅第5节）。
在同一个盘子上分析同一个人的所有时间点，并尽可能多地对样本进行分组。
在整个研究中使用相同的试剂盒批号。
·应按比例比较一个人的时间点结果，以便评估随时间变化的趋势。
·通过分析一式三份的测试样品，将获得宜结果。
如果必须重新测试样本，则使用相关的时间点进行重新测试，即如果一个时间点是意外的，则重新测试该时间点以及同一个人的至少一个或两个额外的时间点。
我们建议离心微管以大限度地回收试剂。试剂过量，以确保所需的容量可以恢复。
所有试剂和样品在使用前必须轻轻旋转。
使用前应立即稀释储备试剂。抗体和结合物的终稀释不稳定超过一天。标准品的终稀释在2-8°C下稳定1周。
每块板上必须包括一套标准（一式两份）。
提供缓冲液III，以制定血清和血浆样品的测量标准。
对于其他样品，应使用等效矩阵来构成标准。例如，对于组织培养，可以使用上清液培养基。
理想情况下，应将样品分为三份进行分析。所有要比较的样品必须经过相同的处理。
避免试剂的微生物污染，特别是储备抗体和共轭物。
GAR-HRP对微生物污染、sodium azide、次氯酸和实验室供水中常见的芳烃高度敏感。
TMB对光高度敏感，不应暴露在玻璃或金属等硅基材料中。
五、标本收藏库
采集血液时不应使用抗凝剂，并应避免溶血。理想情况下，应校准血清样本，立即冷冻，并在以下离心（600 g/3000 rpm，10分钟）下储存，以去除颗粒物质和任何凝块。我不确定我是否能做到。应避免重复冻融循环。
六、结果
用Logistic方程（4或5参数）绘制X轴上标准轴上的标准吸光度读数与标准X射线浓度。注意，标准曲线是乙状结肠的，不是线性的。理想情况下，应使用适当的曲线拟合软件。
高于高标准的任何样品读数应使用缓冲液III稀释并重新分析。
任何低于低标准的样品读数应重新分析或丢弃。
7号。具体性能特征
7.1交叉反应性和特异性
II型胶原（CP II）的C-丙肽由三条相同的35kDa链组成，链间二硫键共价键合。在软骨基质中形成纤维时，CP-II非螺旋结构域与II型前胶原分子分离。用纯化的CP-II蛋白印迹和细菌胶原酶消化的重组II型胶原证实了多克隆抗体对CP-II的特异性。在S35标记的CP-II的western blots/autoradiography中，抗体识别CP-II和至少一种自然降解产物，其氨基末端缺少10 aa。
历*，该检测具有广泛的交叉反应性，可识别人、猴、马、牛、狗、大鼠、小鼠和豚鼠CP-II。然而，新的抗体还没有用这些或任何其他物种进行测试。我们强烈建议在您的条件下测试工具包的性能。
本法适用于血清。它也被IBEX客户用于滑液、血浆、培养基和盐酸胍提取软骨。
这种ELISA利用兔抗体。对含有高浓度兔抗体（如兔血清）的样品进行检测会导致高背景干扰。
终端用户应自行对这些样品和任何其他样品进行验证。
