rtalabs DIAGNOVITAL®2019-NCOV
使用说明
1） 预期用途
本文介绍了实时RT-PCR检测在体外定性检测中的应用
2019年呼吸道标本和血清中的新型冠状病毒（2019 nCoV）。2019 nCoV引物和探针组设计用于2019 nCoV的特定检测。
这些试剂盒遵循疾控中心和世卫组织的新检测指南。
2） DIAGNOVITAL®检测
DIAGNOVITAL®2019-NCOV是基于RT-PCR的2019武汉冠状病毒（2019-NCOV）实时检测系统。2019年nCoV被认为是一种新的人类冠状病毒，与引起季节性急性呼吸系统疾病的常见人类冠状病毒（229E，NL63，OC43，HKU1）有着明显的遗传差异。它在基因上也不同于两个新人类
冠状病毒、MERS-CoV和SARS-CoV。
DIAGNOVITAL®2019-NCOV检测到2019年NCOV存在3个不同且高度特异的基因序列：E基因、N基因和RdRP基因。所有3项化验必须检测为阳性，以确认样本为2019 nCoV阳性。
此外，还包括非感染性阳性对照和阴性人类提取对照。阳性对照用于确认分析的功能和总体PCR性能，阴性人类提取对照用于评估独立于2019年nCoV分析的RNA分离质量。
2.1）基于QPCR的2019-NCOV检测
检测2019株nCoV的一步是将病毒RNA转化为cDNA。之后，通过荧光标记探针，对2019年nCoV*的目标序列进行实时放大监测：当加入新扩增的DNA链时，荧光团（FAM™) 被释放，可以观察到荧光信号的增加。
由于冠状病毒的固有突变率，目标序列中的突变有可能随着时间的推移而发生和积累。这可能导致基于PCR的检测方法出现假阴性结果。DIAGNOVITAL®2019-NCOV通过对3个不同的目标序列使用3种检测分析来解决此问题，以大限度地减少由改变的目标序列导致假阴性结果的机会。
如果样品在一个或多个分析中检测为阴性，则可能需要额外的补充检测。2019年nCoV的原始靶序列作为非感染性靶阳性对照（TPC）包括在内，以检查检测分析的完整性。
应始终通过补充方法和独立实验室中的附加分析来确认检测呈阳性的样品。
PRODUCT SIZE SKU
DIAGNOVITAL®2019-NCOV
50 rxn / 20 µl PCC
SKU15259
2.2) MATERIALS PROVIDED
QUANTITY AND VOLUME COMPONENT
2.3）所需附加材料
•核酸提取的适当方法和设备（见第3.4章）
•为FAM配备实时PCR检测系统™ 侦查
•可调移液管和安装过滤移液管头
•适当的PSA和工作区，用于处理潜在感染性样本
•表面去污剂，如DNAZap™ （生命科技），远离DNA™ （费舍尔科学），离开™ （Fisher Scientific），10%漂白剂（市售5.25-6.0%次氯酸钠的1:10稀释度）
•无核酸酶管/条/板，用于制备稀释液、主混合物等；与PCR装置相对应的无核酸酶管/条/板
•试剂和样品的适当储存选择（4℃、-20℃、-70℃）
2.4）储存
•将所有部件储存在-20°C下，避免重复冻融循环。•保护2X qPCR主混合料不受光照，因为长时间曝光会降低荧光粉的性能。
3） 开始前的注意事项
3.1）生物安全•穿戴适当的个人防护装备（如长袍、无粉手套，
当使用临床样本时。•应按照生物安全2级或更高级别的指南，在经认证的二级生物安全柜中进行样本处理。
3.2）试样
仅使用适当的样本进行测试，例如：•呼吸样本，包括鼻咽/口咽抽吸物或冲洗液、鼻咽/口咽拭子、支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物和痰。•拭子样本只能在带有合成的拭子上采集（例如
聚酯或涤纶（带铝或塑料轴）。不接受含有海藻酸钙的棉签或带有木轴的棉签
3.3）试样-搬运和储存
•采集后，样品可在4°C下保存72小时。
•如果预计提取会延迟，则将样品储存在-70°C或更低的温度下。
•提取的核酸应储存在-70°C或更低的温度下。
如果
•未将其保存在2-4°C（≤4天）或在-70°C或更低温度下冷冻。
•标签不足或缺乏文件。
•它们不适用于此目的（有关合适的样品材料，见上文）。
•样本容量不足。
3.4）样品制备/核酸提取：RT-PCR检测的性能很大程度上取决于样品模板RNA的量和质量。强烈建议在测试样本之前，对回收和纯度的RNA提取程序进行鉴定和验证。•与DIAGNOVITAL®检测试剂盒成功结合使用的合适核酸提取系统包括：bioMérieux NucliSens®系统、QIAamp®病毒RNA小试剂盒、QIAamp®Minelote病毒自旋试剂盒或RNeasy®小试剂盒（QIAGEN）、EZ1 DSP病毒试剂盒（QIAGEN）、Roche MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒、Roche MagNA Pure
紧凑型核酸分离试剂盒、罗氏麦格纳纯96 DNA和病毒核酸小容量试剂盒、Invitrogen ChargeSwitch®总RNA细胞试剂盒。
•将剩余样本和提取的核酸保存在-70°C下。•仅解冻一天内要测试的样本提取物数量。
•测试前不要冷冻/解冻提取物超过一次，因为每次冷冻/解冻循环都会降低RNA质量。•根据样本类型，可以直接使用患者样本。
然而，这可能需要预先的溶解步骤和滴定样品上的量，可以在不抑制反应的情况下使用。此过程尚未验证，请使用
建议分离RNA。
3.5）反应装置
1） 在开始实验之前，确保所有必要的设备和装置都是合适的、校准的和功能正常的。
2） 对设备和工作区进行净化，并准备好以下实验所需的一切，以保持工作流程的简短和可重复性。
3） 打开PCR检测系统并对其进行编程，以避免在设置反应后出现延迟。
4） 在冰上解冻DIAGNOVITAL®2019-NCOV的所有成分，并轻轻但*地混合，以确保成分均匀分布。快速旋转收集管底部的液体。
5） 对于一个测试，准备一系列的RNA稀释来确定理想的浓度窗口。建议的样品体积小于终反应体积的10%。
6） 设置Mastermix板：
a、 务*无核酸酶的二氧化二氢（dH2O）代替样品材料（NTC）制备对照反应，以检测试剂中的污染。
b、 始终包括阴性人类提取控制（HEC）的分析，以评估您的RNA分离物的质量。
c、 当使用提供的靶阳性对照品（TPC）时，使用1微升/反应，并将无核酸酶的dH2O添加到20微升。
d、 强烈推荐2份以上的复制品/样品。
e、 为所有计划的反应准备足够的混料。建议为2个附加反应制备mastermix，以补偿移液误差。
f、 将混合料分发到板条/盘子中。示例设置如图1所示。
OMPONENT VOLUME
50X DIAGNOVITAL®Reverse Transcriptase 0.4 µl
DIAGNOVITAL®2X qPCR Mastermix (E / N / RdRP / HEC) 10 µl
isolated sample RNA / TPC X µl / 1 µl
Nuclease-free dH2O to 20 µl
7） 将Mastermix板转移到单独的工作区以添加样品材料。
在单独的工作区准备试剂和终反应装置有助于避免设备和试剂与样品材料的污染。
a、 在处理阳性样品之前，先准备好阴性反应并密封。建议在制备和密封NTC后，仅将潜在阳性样品材料和包含的目标阳性对照品带到工作区。
b、 将您的样品添加到Mastermix板中。示例设置如图2所示。
