k-assay大鼠肌酸激酶 MB 同工酶 (CKMB) ELISA

用于定量测定血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养中的大鼠 CKMB上清液和其他生物液体。

kamiya目录号编号KT-12247

仅供研究使用。

产品信息

大鼠肌酸激酶 MB 同工酶 (CKMB) ELISA

 目录号编号KT-12247

 预期用途

试剂盒是一种夹心酶免疫测定法，用于体外定量测定血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清液和其他生物体液中的大鼠 CKMB。仅供研究使用。

 组件

需要但未提供的材料

1. 带有 450±10 nm 滤光片的酶标仪。

2. 具有高精度和一次性枪头的单道或多道移液器。

3. 微量离心管。

4. 去离子水或蒸馏水。

5. 吸水纸吸干微孔板。

6. 清洗液容器。

7. 0.01 mol/L（或 1x）磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.0-7.2。

 储存

所有试剂均应按照小瓶上的标签保存。校准品、检测试剂 A、检测试剂 B 和 96 孔板条接收后应在-20 ℃ 下储存，其他板条应在 4 ℃ 下储存。未使用的板条应保存在密封袋中，并提供干燥剂，以尽量减少暴露于潮湿空气。开封的检测试剂盒将在 1 个月内保持稳定，前提是按照上述方法储存。

测试原理

本试剂盒中提供的微孔板已用 CKMB 特异性抗体预包被。然后用 CKMB 特异性生物素结合抗体将校准品或样本加入适当的微孔板孔中。然后，将偶联辣根过氧化物酶 (HRP) 的抗生物素蛋白加入到每个微孔板小孔中并孵育。加入 TMB 底物溶液后，仅含 CKMB、生物素结合抗体和酶结合抗生物素蛋白的微孔显示颜色变化。酶-底物反应终止  by  的  添加  of  硫酸的  酸  溶液  和  的  颜色  变更  is  采用分光光度法在 450 nm±10 nm 波长处测定。然后通过比较样本的 O.D. 与校准曲线，测定样本中 CKMB 的浓度。

 样本采集和储存

血清

使用血清分离管，使样本在室温下凝结 2 小时或在 4 °C 下过夜，然后以约 1,000 xg 离心 20 min。立即测定新鲜制备的血清或将等份样本储存在-20 °C 或-80 °C 下备用。避免反复冻融循环。

血浆

使用 EDTA 或肝素作为抗凝剂采集血浆。采集后 30 min 内，在 4 ℃ 下以 1,000 xg 离心样本 15 min。立即取出血浆并测定，或将等分样本储存在-20 °C 或-80 °C 备用。避免反复冻融循环。

组织匀浆

组织匀浆的制备因组织类型而异。

1. 在冰冷 PBS 中冲洗组织，*除去过量血液，并在匀浆前称重。

2. 将组织切成小块，并在冰上用玻璃匀浆器（Micro tissue Grinders works，也是如此）在新鲜裂解缓冲液（需要根据目标蛋白的亚细胞位置选择不同的裂解缓冲液）（w:v = 1:20-1:50，例如在 20-50 mg 组织样本中加入 1 mL 裂解缓冲液）中匀浆化。

3. 用超声细胞破碎仪对所得混悬液进行超声处理，直至溶液澄清。

4. 然后，匀浆以 10,000×g 离心 5 min。立即收集上清液并进行测定，或等分并在≤-20 ℃ 下储存。

细胞裂解物

根据以下说明进行测定前，需要裂解细胞。

1. 贴壁细胞应用冷 PBS 轻轻洗涤，然后用胰蛋白酶分离，1 000 xg 离心 5 min 收集（悬浮细胞可直接离心收集）。

2. 在冷 PBS 中清洗细胞三次。

3. 在浓度为 10 的新鲜裂解缓冲液中重悬细胞⁷ 细胞/mL。 If it is 必要， 的 细胞 可能是 接受 to 超声处理 至 的 溶液 is 澄清。

4. 在 4 °C 下以 1,500 xg 离心 10 min，除去细胞碎片。立即测定或等分并在≤-20 ℃ 下储存。

细胞培养上清液和其他生物体液

以 1,000 xg 离心样品 20 min，立即收集上清液并进行测定，或将等份样品储存在-20 °C 或-80 °C 备用。避免反复冻融循环。

 注：

1. 5 天内使用的样品可在 4<unk>C 下储存，否则样品必须在-20<unk>C（≤1 个月）或-80<unk>C（≤2 个月）下储存，以避免失去生物活性和污染。

2. 进行试验时，将样品恢复至室温。

3. 样本溶血会影响结果，因此不应使用溶血标本。

4. 根据我们内部数据量，强烈建议使用血清代替血浆进行检测。

试剂制备

使用前，将所有试剂盒组分和样本恢复至室温 (18-25 ℃)。如果试剂盒不能一次性用完，请只取出试纸条和试剂进行现实验，剩余试纸条和试剂留作所需条件。

校准品

用 1.0 mL 校准品稀释液复溶校准品，室温下放置 10 min，轻轻振摇（不得起泡）。储备液中校准品的浓度为 200 ng/mL。请先将原液稀释至 100 ng/mL，稀释后的校准品作为高浓度校准品 (100 ng/mL)。然后准备 7 个含有 0.5 mL 校准品稀释液的试管，根据下图，使用经稀释的校准品制备双倍稀释系列。在下一次转移前，充分混匀各试管。设置 7 个稀释校准品点，例如 100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.12 ng/mL、1.56 ng/mL，后一个含有校准品稀释液的 EP 管为空白，浓度为 0 ng/mL。

检测试剂 A 和检测试剂 B

使用前短暂离心或离心储备液检测 A 和检测 B。分别用试验稀释剂 A 和 B 将其稀释至 100 倍工作浓度。

清洗液

用 580 mL 去离子水或蒸馏水稀释 20 mL 浓缩液 (30X)，制备 600 mL 清洗液 (1X)。

TMB 底物

用无菌吸头吸取所需剂量的溶液，不得将残留溶液再次倒入小瓶中。

注：

1. 在测定前 15 min 内制备校准品。请勿在 37 ℃ 下溶解试剂°C 直接。

2. 不允许在微孔中直接进行连续稀释。

3. 请按照说明仔细复溶校准品或工作检测试剂 A 和 B，避免起泡并轻轻混合，直至晶体*溶解。为尽量减少移液造成的不精密度，使用小体积并确保移液器经过校准。建议一次移液抽吸 10 μL 以上。

4. 重组校准品、检测试剂 A 和检测试剂 B 只能使用一次。

5. 如果在清洗浓缩液 (30X) 中形成晶体，则加热至室温并轻轻混合，直至晶体*溶解。

6. 污染的水或试剂配制容器会影响检测结果。

样品制备

1. 我们仅对试剂盒本身负责，而不对测定过程中消耗的样本负责。用户应计算整个检测中可能使用的样本量。请提前预留足够的样本。

2. 请在测定前预测浓度。如果这些值不在校准曲线范围内，则用户必须确定其特定实验的宜样本稀释度。应使用 PBS 稀释样本。

3. 如果手册中未指明样本，则有必要进行初步实验以确定试剂盒的有效性。

4. 通过化学裂解缓冲液制备的组织或细胞提取样本，由于某些化学物质的影响，可能会导致意外的 ELISA 结果。

5. 由于其他来源的抗原和我们试剂盒中使用的抗体之间可能存在错配（例如，抗体靶向构象表位而不是线性表位），一些来自其他生产商的天然或重组蛋白可能无法被我们的产品识别。

6. 受细胞活力、细胞数量或取样时间等因素影响，试剂盒可能无法对细胞培养上清液样本进行检测。

7. 建议使用未经长期储存的新鲜样本进行试验。否则，这些样品可能发生蛋白质降解和变性，终导致错误结果。

分析方法

1. 测定稀释校准品、空白和样品的微孔。校准品制备 7 孔，空白制备 1 孔。向适当的孔中分别加入 100µL 校准品稀释液（读取试剂制备）、空白和样本。用封板覆膜覆盖。在 37 ℃ 下孵育 1 小时。

2. 清除各孔中的液体，不要清洗。

3. 向各孔中加入 100µL 检测试剂 A 工作液，用封板覆膜覆盖孔，并在 37 ℃ 下孵育 1 小时。

4. 吸取该溶液，并使用喷雾瓶、多通道移液器、歧管分配器或自动洗涤器用 350µL 1X 清洗液清洗每个孔，并静置 1-2 min。通过将微孔板卡在吸水纸上，*去除所有微孔中的剩余液体。总共清洗 3 次。后一次洗涤后，通过抽吸或倾倒除去任何剩余的洗涤缓冲液。倒置平板，在吸水纸上吸干。

5. 向各孔中加入 100µL 检测试剂 B 工作液，用封板覆膜覆盖孔，并在 37 ℃ 下孵育 30 min。

6. 按照步骤 4 重复抽吸/清洗过程共 5 次。

7. 向各孔中加入 90µL 底物溶液。用新封板覆膜覆盖。在 37 ℃ 下孵育 10-20 min（不得超过 30 min）。避光保存。加入底物溶液后液体将变蓝。

8. 向各孔中加入 50µL 终止液。加入终止液后，液体将变黄。轻敲微孔板侧面，混合液体。如果颜色变化不均匀，轻轻敲击平板以确保充分混合。

9. 取下平板底部的水滴和指纹，确认液体表面无气泡。然后运行酶标仪，立即在 450 nm 处测定。

注：

1. 试验准备：每次实验保留适当数量的孔，并从微孔板中取出额外的孔。其余孔应重新密封并储存在-20 ℃ 下。

2. 样本或试剂添加：请使用新鲜制备的校准品。请小心地向孔中加入样品并轻轻混合以避免起泡。请勿触摸孔壁。对于程序中的每个步骤，向测定板中加入试剂或样品的总分配时间不应超过 10 min。这将确保每个移液步骤的运行时间相等，不会中断。建议重复检测所有校准品和样本，尽管不是必需的。为避免交叉污染，在添加校准品、样本和试剂之间更换移液器吸头。此外，每种试剂使用单独的储液器。

3. 孵育：为确保结果准确，孵育步骤期间必须适当粘附封板覆膜。在孵育步骤之间，不得使孔长时间处于未覆盖状态。试剂加入微孔板条后，在测定过程中的任何时间都不要让板条变干。必须控制孵育时间和温度。

4. 清洗：清洗程序至关重要。在每个步骤中*去除液体对于良好性能至关重要。后一次洗涤后，通过抽吸或倾倒除去任何剩余的清洗液，并除去平板底部的任何水滴和指纹。清洗不充分将导致精密度较差和吸光度读数假性升高。

5. 反应时间的控制：观察加入 TMB 底物后颜色的变化（如每 10 min 观察一次），如颜色过深，应提前加入终止液，避免反应过强，导致吸光度读数不准确。

6. TMB 底物容易被污染。请避光保存。

7. 低于 60% 的环境湿度可能会对终性能产生一些影响，因此，建议在该条件下使用加湿器。

结果计算

计算每个校准品、质控品和样本的重复两次读数的平均值，并减去平均零校准品光密度。通过绘制每份校准品的平均 od 值和浓度，构建校准曲线，并通过该曲线图上的点绘制适合拟合曲线，或在对数-对数曲线图纸上以 CKMB 浓度为 y 轴，以吸光度为 x 轴，创建校准曲线。还建议使用一些 plot 软件。如果样本已被稀释，则从校准曲线读取的浓度必须乘以稀释因子。

性能

检测范围

1.56–100 ng/mL。

用于 ELISA 的校准曲线浓度为 100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.12 ng/mL、1.56 ng/mL。

 灵敏度

CKMB 的小可检测剂量通常低于 0.67 ng/mL。

该试验的灵敏度或检测下限 (LLD) 定义为可与零区分的低蛋白浓度。通过将 20 次零校准品重复测定的平均光密度值加上两个标准差并计算相应的浓度来确定。

专属性

该方法检测 CKMB 具有较高的灵敏度和*的特异性。

分析方法总结

1. 准备好所有试剂、样本和校准品；

2. 向各微孔中加入 100 μL 校准品或样本。37 °C 下孵育 1 小时；

3. 吸出并加入 100 μL 制备的检测试剂 A。在 37 ℃ 下孵育 1 小时；

4. 抽吸并清洗 3 次；

5. 加入 100 μL 制备好的检测试剂 B，37 °C 孵育 30 min；

6. 抽吸并清洗 5 次；

7. 加入 90 μL 底物溶液。37 °C 下孵育 10-20 min；

8. 加入 50 μL 终止液。立即在 450 nm 处读数。

重要说明

1. 终实验结果将与产品的有效性密切相关，因此试剂盒应在失效日期前使用。请严格按照说明储存试剂盒。

2. 不同批次试剂盒的检测范围、灵敏度和显色时间可能略有不同。请严格按照试剂盒随附说明书进行实验，本公司网站电子版仅供参考。

3. 请勿将不同批次试剂盒中的试剂混合或替代。仅使用制造商提供的试剂。

4. 储存和孵育期间，所有试剂均应避免强光照射。所有试剂瓶盖均应盖紧，防止微生物的蒸发和污染。TMB 底物应保持无色，直至与结合微孔板的酶反应。

5. 首次开板时孔内可能有一些雾状物质。对终试验结果无任何影响。在需要之前，请勿从储存袋中取出微孔板。

6. 试剂制备和加载过程中的错误操作，以及酶标仪参数设置不正确可能导致结果不正确。带宽为 10 nm 或更低，在 450±10 nm 波长下光密度范围为 0-3 O.D. 的酶标仪可用于吸光度测量。实验前请仔细阅读说明书并调整仪器。

7. 样品制备和实验操作的每个步骤的变化可能导致不同的结果。为了获得更好的重现性结果，应控制试验中每个步骤的操作。

8. 每个套件均已严格通过 Q.C 测试。然而，由于一些非预期运输条件或不同的实验室设备，终端用户的结果可能与我们的内部数据不一致。不同批次试剂盒之间的试验内差异也可能由上述因素引起。

9. 来自不同制造商的具有相同项目的套件可能产生不同的结果，因为我们尚未将我们的产品与其他制造商进行比较。

10. 用于抗体制备的试剂盒校准品和免疫原通常为重组蛋白，由于重组蛋白制备中可能会用到不同的片段、表达系统、纯化方法等，我们无法保证试剂盒能够检测到其他公司的重组蛋白。所以，不建议使用试剂盒进行重组蛋白的检测。

11. 请预测样本中目标分子的浓度，或者安排预实验，是解决具体问题的好方法，例如样本的浓度超出试剂盒的检测范围。

12. 由于其有效性的不确定性，该试剂盒可能不适用于检测一些特殊实验的样本，例如基因敲除实验。

13. 建议与该试剂盒一起使用的终止液是一种酸性溶液。使用本材料时，请佩戴眼睛、手、面部和防护服。

仅供研究使用。

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