aatbio酶联免疫吸附测定

aatbio酶联免疫吸附测定（ELISA）

ELISA或酶联免疫吸附测定法是一种基于板的免疫测定法，用于检测和定量生物分子，例如抗体，蛋白质，激素或肽，以及表征蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用。在ELISA中，通常将感兴趣的靶标（通常是抗原）固定在固体表面上，然后用与诸如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的酶缀合的抗体进行探测。通过与被酶催化的底物孵育来实现定量，从而产生可测量的副产物。

目录

1. ELISA概述
   1. 1.1 直接与间接检测
2. ELISA格式
   1. 2.1 直接ELISA
   2. 2.2 间接ELISA
   3. 2.2 夹心ELISA
3. ELISA抗体和其他探针
   1. 3.1 HRP和多HRP二抗
   2. 3.2 HRP和AP链霉亲和素结合物
4. ELISA底物和检测策略
   1. 4.1 比色ELISA底物
   2. 4.1 荧光ELISA底物
   3. 4.1 化学发光ELISA底物
5. 产品订购信息

ELISA概述（酶联免疫吸附测定）

ELISA测定法通常在96孔聚苯乙烯微量滴定板中进行。这些板被设计成通常通过直接吸附到微量滴定板的表面上或间接地通过预先包被的“捕获”抗体间接地结合和固定抗原。固定后，将一抗引入样品中，与抗原形成免疫复合物。一级抗体可以共价标记到酶（例如HRP）上，或者如果一级抗体被生物素标记，则一级抗体本身可以使用酶标记的二级抗体或链霉亲和素偶联物间接检测。通过与合适的底物孵育来评估共轭酶的活性，从而实现检测，该底物会产生可测量的副产物。基材在灵敏度和与成像设备的兼容性方面各不相同，

直接与间接检测

在ELISA中检测一级抗体-抗原复合物的方法可以是直接的或间接的（图1）。在直接检测方法中，与报告酶（例如HRP或AP）缀合的单一一抗用于一步步骤中，以直接检测靶抗原。通过间接检测，可以依次使用双抗体系统检测目标靶标。首先，将样品与针对目标抗原的未标记一抗孵育。然后，使用一抗特异的酶标二抗检测其存在，从而检测靶抗原。如果使用生物素化的一抗检测抗原，则使用酶标记的抗生蛋白链菌素偶联物作为您的第二检测试剂。

确定使用哪种检测方法取决于靶抗原的表达水平。为了检测高度表达的抗原，直接检测是合适的方法。当灵敏度至关重要时，例如检测低丰度靶标或表达不良的抗原，请使用间接检测方法来增强信号。

图1.使用靶标特异性抗体进行直接和间接抗原检测的图示。

ELISA格式

尽管存在ELISA的几种变体，但它们具有相似的关键一步，即抗原固定。这可以通过抗原直接吸附到孔表面来实现，也可以使用“捕获”抗体间接实现。在后一种方法中，固定在孔表面的“捕获”抗体结合并保留抗原。固定后，酶联抗体可用于检测和量化目标靶标。考虑到所有因素，ELISA通常分为三类：

• 直接ELISA
• 间接ELISA
• 夹心ELISA

直接ELISA

在直接ELISA中，抗原通过被动吸附直接固定在板的表面，并使用HRP标记的一抗进行检测。将无色底物引入样品，该底物与酶结合物反应，并产生可测量的副产物。根据底物的选择，该副产物可以是比色的，化学发光的或荧光的。信号产生的大小与样品中抗原的数量成正比。在所有ELISA格式中，直接ELISA分析简单，执行快，但灵敏度低。

方案：比色直接ELISA

1. 用检测抗原包被ELISA板，密封板并在4°C下孵育过夜
2. 去除涂料溶液并用所需的缓冲液冲洗板两次
3. 在4°C下用所需的封闭溶液封闭板1小时
4. 用缓冲液洗板3次
5. 与HRP标记的一抗体在室温下孵育1小时
6. 用缓冲液洗板4次
7. 在室温下用ReadiUse™TMB底物溶液（货号11012）接种板15-30分钟。
8. 用ELISA酶标仪测量650 nm处的吸光度信号

图2.直接ELISA图解。

间接ELISA

间接ELISA本质上是直接ELISA的修改版本。在间接ELISA中，用于检测抗原的一抗是未偶联的。取而代之的是，对一级抗体的宿主物种具有反应性的酶标二级抗体被用于检测一级抗体-抗原复合物（间接检测抗原）。将无色底物引入样品，该底物与酶结合物反应，并产生可测量的副产物。根据底物的选择，该副产物可以是比色的，化学发光的或荧光的。信号产生的大小与样品中抗原的数量成正比。与直接ELISA相比，使用辅助检测试剂具有明显的优势，即信号放大。

方案：比色间接ELISA

1. 用检测抗原包被ELISA板，密封板并在4°C下孵育过夜
2. 去除涂料溶液并用所需的缓冲液冲洗板两次
3. 在4°C下用所需的封闭溶液封闭板1小时
4. 用缓冲液洗板2次
5. 与未偶联的一抗在室温下孵育1小时
6. 用缓冲液洗板4次
7. 在室温下与HRP标记的二抗（在封闭缓冲液中）孵育1小时
8. 用缓冲液洗板4次
9. 在室温下用ReadiUse™TMB底物溶液（货号11012）接种板15-30分钟。
10. 用ELISA酶标仪测量650 nm处的吸光度信号

图3.间接ELISA图解。

夹心ELISA

夹心ELISA分析是常用的ELISA形式。它需要使用匹配的抗体对，从而每种抗体对抗原上不同的非重叠表位具有特异性。首先将一种抗体，称为捕获抗体，包被在多孔微量滴定板的表面上，以促进靶抗原的固定。然后，第二种抗体（称为检测抗体）与捕获抗体-抗原复合物结合（因此，术语“三明治”因为抗原被结合在匹配的抗体对之间）。添加对检测抗体（而非捕获抗体）具有特异性的酶标记的第二抗体偶联物。一旦二级抗体与检测抗体结合，

方案：比色夹心ELISA

1. 用捕获抗体，密封板包被PCV微量滴定板的孔，并在4°C下孵育过夜
2. 去除涂料溶液并用所需的缓冲液冲洗板两次
3. 在4°C下用所需的封闭溶液封闭板1小时
4. 用所需缓冲液洗板2次
5. 向每个孔中添加样品，在37°C下孵育2小时
6. 取出样品并用所需缓冲液洗板2次
7. 与未偶联的检测抗体在室温下孵育1小时
8. 用所需缓冲液洗板4次
9. 在室温下与HRP标记的二抗（在封闭缓冲液中）孵育1小时
10. 用所需缓冲液洗板4次
11. 在室温下用ReadiUse™TMB底物溶液（货号11012）接种板15-30分钟。
12. 用ELISA酶标仪测量650 nm处的吸光度信号

图4.夹心ELISA图。

ELISA抗体和其他探针

单克隆抗体，多克隆抗体或二者的组合通常在ELISA分析中用作检测或捕获抗体。单克隆抗体固有地是单价的，对每个抗原的单个表位具有特异性。在所有ELISA格式中，单克隆抗体通常用作检测抗体。因为它们很少与其他蛋白质发生交叉反应，所以它们不太可能产生非特异性信号。相反，作为抗体的复杂混合物的多克隆抗体识别在单个抗原中发现的多个表位。尽管它们经常在夹心ELISA分析中用作“捕获抗体”，以拉低尽可能多的抗原，但它们也可用作检测抗体。多克隆抗体极易发生批次间变化，

ELISA二级探针

酶联二抗或链霉亲和素共轭物经常用于间接和夹心ELISA分析中。它们放大弱信号的能力使其在检测表达不良的抗原方面具有优势。

HRP和多HRP二抗

辣根过氧化物酶（（HRP，目录号11025通常与第二抗体或抗生蛋白链菌素偶联，用于间接或夹心ELISA分析。HRP作为ELISA报告基因的广泛采用主要是由于三个因素。首先，HRP具有扩增弱信号和增强表达不良抗原的可检测性的能力。其次，与其他报告酶（例如碱性磷酸酶（〜140 kDa））相比，HRP的尺寸相对较小（〜44 kDa），进一步提高了细胞内渗透到样品中的能力，减少了空间位阻，并使免疫反应性损失小化。第三，HRP的高周转率和良好的稳定性可实现快速而强大的信号生成。AAT Bioquest提供与HRP和poly-HRP偶联的高度纯化和交叉吸附的第二抗体。MegaWox™聚HRP二级结合物旨在在ELISA分析中提供高水平的灵敏度和低背景。在样品量有限或目标分子表达较差的免疫分析中使用MegaWox™聚HRP结合物。

HRP和AP链霉亲和素结合物

当用于检测抗原的一抗被生物素分子标记时，酶标记的抗生蛋白链菌素结合物可用于ELISA中。链霉亲和素的四聚体构象使其能够以高亲和力和选择性结合多达四个生物素分子。这种多样性使得能够放大弱信号，并提高了对中，低丰度目标的检测灵敏度。链霉亲和素以现成的形式与HRP或AP结合。

ELISA底物和检测策略

所有ELISA分析的后一步是添加酶底物的检测步骤。酶（例如HRP或AP）将底物催化成可测量的副产物，并且产生的信号强度与样品中的抗原量成正比。ELISA底物在易用性，灵敏度和与成像设备（例如分光光度计，荧光计和发光计）的兼容性方面有所不同。

比色ELISA底物

比色（或生色）底物与酶反应生成可观察到的有色副产物，可以使用吸光度板读数器进行测量。AAT Bioquest提供辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）的比色底物，其灵敏度和光密度范围都很大。

荧光ELISA底物

荧光（或荧光）底物与酶反应生成高度荧光的副产物，可使用荧光酶标仪进行测量。光激发后的光子发射程度与样品中的抗原量成正比。AAT Bioquest提供了辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）的荧光底物，其灵敏度和荧光特性均在此范围内。

化学发光ELISA底物

化学发光底物与酶反应生成发光副产物，可以使用发光计进行测量。由于光子的发射是化学反应而非光激发的结果，因此背景干扰小。AAT Bioquest提供了辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）的化学发光底物，其敏感性和化学发光特性均在这一范围内。

产品订购信息

通用ELISA试剂盒