squarix ME043.1说明书 

目录号编号ME043.1（RPA.1）(1 mg)

目录号编号ME043.2（RPA.2）(5 mg)

罗丹明 B-[（1,10-二氮杂菲-5-基）-氨基羰基] 苄酯

• Fe2 + 特异性荧光“传感器”
• 线粒体特异性
• 线粒体可螯合铁池的测定
• 线粒体铁摄取评估
• 病理状态下线粒体可螯合铁池改变的评估
• 线粒体可螯合铁对生理和病理细胞过程的作用评估
• 铁减少评估

荧光“铁传感器”RPA 和 RDA 选择性测定活细胞线粒体可螯合铁

铁对许多生物过程至关重要，但也是有害的，因为它促进产生高度破坏性的氧物种。线粒体可螯合铁被认为是导致几种人类疾病。过去，由于线粒体蓄积不足或铁选择性指标的细胞分布均匀，试图测定可螯合铁的线粒体内池存在问题 (Lit 3)。荧光无毒的“铁传感器”RPA 和 RDA 是一个，它允许在单个完整线粒体中特异性地确定这种铁池。它们是评估不稳定（“氧化还原活性”）铁功能的新工具，例如在自由基参与的细胞和组织损伤过程中。

产品信息

RPA 作为生物样品中 Fe (Ⅱ) 的选择性、高量子产率荧光标记物。透膜化合物的阳离子荧光团允许通过例如荧光显微镜进行观察，并且基于线粒体的负膜电位，特别是靶向活细胞的线粒体。在无细胞系统中，RPA 荧光 (max 601 nm) 被 Fe2 + 离子强烈化学计量淬灭。

1,2

1

0,8

0,6

A

例如：564 nm 发射：603 nm

120 B

100 ·

80 ·

60

RPA (µM)

• 45

0,4

30

40

20 · ·

0,2       20

0 0

· · ·

· · · · ·

450 550 650 750

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

FAS (µM)

A：无细胞系统中 RPA（20 MRPA 的“简单缓冲液”(SBS)：2 mM 抗坏血酸盐、0.15%SDS 和 10 mM Tris/HCl，pH 8.2）的吸光度和发射光谱。

B：Fe2 + 对“SBS”中 RPA (20-45 M) 荧光的影响：Fe2 +，作为添加的储备液 (1 mM) 中硫酸亚铁铵/柠檬酸三钠盐二水合物 (FAS) 浓度的增加添加。含 20 mM 抗坏血酸盐，与培养基混合。在 RPA/Fe2 + 复合物*形成后 2 min，测定含已知浓度 RPA 和 Fe2 + 的培养基部分的荧光（以任意单位 a.u. 表示）。零荧光等于无染料培养基的荧光。

RPA 选择性蓄积在培养肝细胞的线粒体中 (Lit 1,2)。当铁以膜渗透形式加入细胞时，线粒体内 RPA 荧光被淬灭。当实验可用的线粒体可螯合铁时，其增加

加入透膜过渡金属螯合剂吡哆醛异烟酰腙和 1,10-二氮杂菲后，膜透性降低。这种 RPA 荧光的增加允许使用离体原位校准 (Lit 1) 特异性定量活细胞中的线粒体可螯合铁。

在细胞系统中的应用

RPA 可按 Lit 所述使用。1. 在盖玻片或 Pentz 小室培养的活细胞与 RPA（0.01-10µM，由 10µM 或 1 mM DMSO 储备液制备）在 HBBS（“Hanks 平衡 sot 溶液”）中于 37 ℃ 孵育 10-12 min。随后用无染料 HBBS 清洗细胞 3 次。为了避免 RPA 与小室结合并改善线粒体负荷，RPA 负荷后应将细胞转移到第二个（无指示剂）Pentz 小室，再孵育 15 min。在 37 °C 条件下。现在应在 37 °C 条件下用适当的培养基（例如肝细胞用 HBBS 或 L-15 培养基）覆盖细胞。使用例如定量激光扫描显微镜测定线粒体内 RPA 荧光。RPA 的红色荧光在 exc. = 543 nm 处激发，并通过 exc. = 601 nm 附近的长通滤光片收集。定量和定性测量的扫描参数取决于用于实验的显微镜系统。通过加入 FeCl3/8-羟基喹啉复合物 (5-15µM) 或膜渗透性铁螯合剂，例如 PIH（吡哆醛异烟酸腙，2 mM）或 1,10-二氮杂菲 (2 mM)，开始测定后 5-10 min 可控制可螯合铁的线粒体内水平。对于对照测量，平行培养物上样含有相同荧光团的铁不敏感对照 RPAC（罗丹明 B-[（菲-9-基）氨基羰基] 苄基酯）。应使用与上述相同的加载条件。

原位校准

通过比较 PIH (2 mM)“去淬灭”后的线粒体荧光（任意单位）与溶解在“线粒体培养基”中的 RPA 标准品 (5-80µM) 的荧光，测定线粒体内 RPA 浓度的离体校准（组成见文献 1）。为了获得校准曲线，将 100µl 已知 RPA 浓度的培养基部分置于细胞实验中使用的相同盖玻片上。在无细胞离体测量中，使用与细胞荧光定量测量相同的焦平面和激光扫描参数。

Fe2 + 诱导 RPA 荧光猝灭的离体标定

1 mL“线粒体培养基”（见 Lit.1）转移至 1.5 mL 试管中，37 ℃ 孵育。加入 RPA (20-80µM)。加入新鲜制备的含 20 mM 抗坏血酸盐的贮备液 (1 mM) 中已知浓度的 FAS（硫酸亚铁铵/柠檬酸三钠盐二水合物）。RPA/Fe2 + 在应用期间形成。2 min 孵育时间。通过使用与细胞荧光定量测量和离体校准相同的焦平面和激光扫描参数测量 RPA 荧光，获得校准曲线。

产品数据

产品名称： RPA

产品代码： ME043.1 (1 mg) 和 ME043.2 (5 mg)

化学名称： 罗丹明 B-[（1,10-二氮杂菲-5-基）-氨基羰基] 苄酯

分子式： C48H44N5O4Br

分子量： 834g/mol

大吸收： max (log) = 564 nm (4.95) ,510-535 宽肩峰

发射大值： 大值 601 nm

稳定性： < 4 ℃，干燥避光储存

外观： 紫色固体

纯度： > 97% (1H NMR，500 MHz)

淬灭化学计量学： RPA/Fe2 + :3:1[mol/mol]

体外毒性： 无毒

使用注意事项

该产物作为生物样品中 Fe (Ⅱ) 的选择性、高量子产率荧光标记物，尤其是在活细胞的线粒体中。可通过荧光光谱法、荧光板进行测量  读者，  FACS，  视频显微镜  和  激光扫描显微镜。  可在 DMSO 中制备 1 mM-5 mM RPA 储备液，等份试样应在-20 ℃ 避光保存。当在-20 ℃ 下适当储存时，溶液可使用至少 2-3 个月。

订购信息

*有关散装包装规格，请咨询。价格不含运费，请咨询。 后更新日期：2020 年 1 月

文献

1. 用新型荧光传感器选择性测定活细胞线粒体可螯合铁；

F. Petrat 等人生物化学。J. (2002) 362,137-147

1. 冷诱导的肝细胞凋亡：非线粒体可螯合铁触发的线粒体通透性转换；U. Rauen et al.《自由基生物学与医学》2003 年第 35 卷第 12 期第 1664-1678 页
2. 活细胞中的可螯合铁池：系统确定的量；F. Petrat et al.生物学化学，第 383 卷，第 489-502 页，2002 年
3. 利用不同铁结合亲和力的线粒体选择性荧光铁指示剂评估可螯合线粒体铁。U. Rauen 等人ChemBioChem 2007,8,341-352
4. 线粒体乌头酸酶的氧化失活导致大鼠原代中脑培养物中铁和 H2O2 介导的神经毒性。David Cantu 等人PlosOne，2009 年 9 月，第 4 卷，第 9 期，第 1-9 页
5. Tryparedoxin 过氧化物酶缺陷使锥虫发生铁噬型细胞死亡。M. Bogacz 等人细胞生物学，2018 年 7 月
6. 线粒体铁蛋白限制氧化损伤调节线粒体铁的有效性：Friedreich 共济失调的保护作用假说。Alessandro Campanella 等人嗯。摩尔遗传学2009,Jan 1;18 (1) :1-11
7. 红细胞对非转铁蛋白铁的摄取。Eugenia Prus 等人贫血。2011;2011:945289
8. 线粒体铁螯合可预防癫痫发作诱导的线粒体功能障碍和神经元损伤。Li-Ping Liang 等人神经科学杂志 2008 年 11 月 5 日，28 (45) 11550-11556
9. 线粒体铁的减少减轻了损伤过程中的心脏损伤。Hsiang-Chun Chang 等人EMBO 分子医学：8 (3) (2016)，247-267
10. 阿霉素的心脏毒性是通过线粒体铁蓄积介导的。Yoshihiko Ichikawa 等人心脏病学。临床研究杂志2014 Feb 3;124 (2) :617–630.
11. 铁螯合剂用于治疗和预防缺血事件后的细胞死亡和器官损伤。Hossein Ardehali 等人2016 年。US20170014397A1，
12. 线粒体铁和能量功能障碍将成纤维细胞和诱导的神经元与泛酸激酶相关的神经退行性变患者区分开来。Paolo Santambrogio 等人疾病神经生物学，第 81 卷，2015 年 9 月，第 144-153 页
13. Shawn 是 SLC25A39/40 的果蝇同系物，是一种促进神经元存活的线粒体载体。Jan R. Slabbaert 等人神经科学杂志 2016 年 2 月 10 日，36 (6) 1914-1929。
14. 铁调节蛋白缺乏损害小鼠胚胎成纤维细胞的线粒体功能。李慧慧等。等人Nature,Scientific Reports 第 8 卷，文章编号：5118 (2018)
15. 铁螯合剂复合物作为早期发育的人红系前体的铁源。J.M. Leimberg et al.,Translational Research 2008,151:88-96
16. Friedreich 共济失调，人淋巴母细胞和成纤维细胞中线粒体不稳定铁无变化。

F. Petrat 等人，J. biology。化学280,8,February 25,pp. 6701–6708,2005

1. 选择性抑制细胞质而不是线粒体核糖体的氨基糖苷类设计者表现出耳毒性降低。Timor Baasov 等人，J. biol。化学289/4，第 2318–2330 页。2014-01-24