LudgerTagTM DMB唾液酸试剂盒

Ludger是一家生物科学公司，专门研究糖生物学的医学应用分析技术。该技术起源于英国牛津大学。它在范围内用于FDA和EMEA批准的生物药品的质量控制中，并可用于支持IND提交。我们从1999年开始运营，已建立了一个客户群，包括*的制药和生物技术公司。

LudgerTagTM DMB唾液酸试剂盒产品指南

Ludger LT-KDMB-A1说明书

Ludger文件编号LT-KDMB-A1-Guide-v6.3

LT-KDMB-A1的质量标准

应用 用于从糖蛋白中释放唾液酸，并用1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基苯标记。2HCl(DMB)。

染料性质 相对分子量 = 225.07 gmol-1

荧光，λex = 373 nm，λem = 448 nm。

结构

O NH₃Cl

O NH₃Cl

同义词 DMB；1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯2盐酸盐；1,3-苯并二氧杂-5,6-二胺2盐酸盐；5,6-二氨基-1,3-苯并二氧杂唑2盐酸盐

描述 该试剂盒含有用于从糖蛋白中释放唾液酸的试剂。释放的唾液酸通过胺化环化反应与DMB染料结合。

样本数量该试剂盒包含用于多达22份样本的试剂和材料，包括唾液酸参比组以及N-乙酰神经氨酸和N-羟乙酰神经氨酸定量标准品。

样品量 通常每次分析从50-200µg糖蛋白开始。我们建议一式三份分析样本。

适用样本 可以标记糖蛋白、糖肽或聚糖释放的任何唾液酸。

储存条件： Store at -18 ℃下避光储存。避免热源、光源和湿气。提供的试剂至少可稳定保存2年。

运输： 产品可在环境温度下运输。

处理： 确保使用的任何玻璃、塑料制品或溶剂不含糖苷酶和环境碳水化合物。所有样本处理程序均使用无粉手套，并避免环境碳水化合物污染。

单瓶试剂开封后，应立即使用其内容物。根据当地安全规则，丢弃任何多余部分。

安全性： 仅供研究使用。不用于人体或药物

请阅读所有所用化学品的安全数据表(SDS)。涉及标记试剂的所有过程均应使用适当的个人安全防护-眼镜、耐化学腐蚀的手套（例如腈），并在适当的情况下在实验室通风橱中进行。

试剂盒内容物

每个试剂盒包含以下各一瓶：

所需的其他试剂和设备

• 加热块、烘箱或类似的干燥器，设置为80 ℃用于唾液酸释放；设置为50 ℃用于唾液酸标记反应
• 移液器范围1-1000µL和吸头
• 真空离心机
• 反应瓶（例如0.5 mL聚丙烯瓶）
• 分析级水，例如。毫居里
• 如果需要复制品，则添加唾液酸标准品[可选]：CM-NEUAC-01；CM-NEUGC-01
• 其他唾液酸标准品Neu5,9Ac2[可选]： CM-NEU5,9AC-01
• 工艺阳性对照品[建议]：Ludger胎球蛋白糖蛋白 GCP-FET-50U

Ludger Bioquant糖肽 BQ-GPEP-A2G2S2-10U

贴标时间线

LudgerTag™标记程序，包括干燥时间和唾液酸从

分析样品，通常需要7小时加上干燥：

程序 时间

样品制备 10 min + 干燥(1-2 h)，可在前一天进行

唾液酸的释放 3 h

DMB标记 3.5 h

总时间： 7 h + 干燥

方法

1. 样品制备
   • 我们建议通过分析取一式三份样品。对于高唾液酸化糖蛋白，使用50µg，对于唾液酸化水平较低的IgG等样品，使用高达200µg。

• 请注意，一些常用于蛋白质的盐/缓冲液可能会干扰唾液酸分析过程。这取决于与缓冲液体积相比采集的样品量（因为大量缓冲液可能影响酸水解过程中溶液的酸度）。在我们的  经验缓冲液（如PBS）在样品浓度高于1 mg/mL且采集50-200µg样品进行分析时不存在问题。

• 我们建议您在整个过程中对样品进行多次控制：阳性过程控制糖蛋白：胎球蛋白糖蛋白：GCP-FET-50U阳性过程定量控制糖肽：BQ-GPEP-A2G2S2-10U阴性过程控制：水

阴性过程对照：样品缓冲液

• 将样品和过程控制等分试样（除非已经干燥）置于0.5 mL聚丙烯小瓶中，并在真空离心机中干燥。

1. 唾液酸释放
   • 将柱温箱设定为80 ℃

• 向样品和过程控制小瓶中加入25µL 2M乙酸溶液。

不符合唾液酸标准：Neu5Ac(CM-NEUAC-01)、Neu5Gc(CM-NEUGC-01)、唾液酸参比组(CM-SRP-01)小瓶；或Neu5,9Ac2(CM-Neu5,9，Ac-01)（如使用）。

• 涡旋溶解，然后短暂离心。

• 将样品和对照品置于设定为80 ℃的烘箱中，孵育2小时(±5 min)。从烘箱中取出，冷却至室温。涡旋并短暂离心。

• 从各样品或过程对照品中取5µL，转移至0.5 mL聚丙烯小瓶中，准备用DMB标记。

如果需要，酸释放样品可在-20 ℃下储存至少2天[Ref1]。

1. DMB标签
   • 将柱温箱设定为50 ℃。

• 向连二亚硫酸钠LT-DITHIO-01小瓶中加入440µL巯基乙醇溶液LT-MERCAPTO-01，并通过移液器吹打混合，直至固体*溶解。

• 将该溶液全部加入DMB Dye LT-DMB-01小瓶中，通过移液器吹打混匀，直至染料溶解。

避免标签试剂暴露于潮湿和光照条件下，并在60 min内使用。

• 向各样品和过程质控品中加入20µL标记试剂，盖上试管盖，涡旋混匀，然后短暂离心，确保标记溶液在小瓶底部。

• 向各唾液酸标准品（Neu5Ac、Neu5Gc、唾液酸参比组，必要时加Neu5,9Ac2）中加入20µL标记试剂，盖上试管盖，涡旋充分混匀，然后短暂离心，确保标记溶液在小瓶底部。

将样品、对照品和标准品置于设定为50 ℃的烘箱中，并在  黑暗。

孵育期间，您可以开始调节LC，以备分析-参见第4节。

• 从烘箱中取出小瓶，向各样品和过程控制中加入475µL水终止反应

向各唾液酸标准品中加入480µL水

1. LC分析

稀释用于标准曲线的Neu5Ac和Neu5Gc标准品（使用表1作为指导，因为Neu5Gc的含量通常低于Neu5Ac，Neu5Gc曲线的范围比Neu5Ac低一个步骤）。混匀。

这可以在“HPLC条件色谱柱”运行正在进行时完成。

表1.标准品的稀释方案

• 用水（20µL样品 + 180µL水）以1:10（比例1:9）稀释样品。

• 用水以1:10（比例1:9）稀释工艺对照品（和Neu5,9Ac2，如使用）。

• 请勿稀释唾液酸参比盘(SRP)。

注：如果已知样品具有低水平的唾液酸化（例如IgG）-则不要用水稀释。如果发现LC峰面积不在标准曲线范围内，则制备浓度更高的样品或延长标准曲线。

样品在自动进样器中于10 ℃避光条件下可稳定至少72 h[Ref2]。

• 准备LC系统。确保溶剂管线已预充。溶剂A = 乙腈：甲醇：水(9:7:84)

溶剂B = 乙腈

荧光：激发波长：373 nm；发射波长：448 nm；柱温 = 30 ℃；样品温度 = 10 ℃

表2.采用LudgerSep-R1色谱柱（4.6 x 150 mm，3µm颗粒）LS-R1-4.6 x 150进行HPLC分析的30 min运行方法。

进样量 = 25µL。

表3使用LudgerSep-uR2色谱柱（2.1 x 100 mm，1.9

µm微粒）LS-UR2-2.1 x 100。

进样量 = 5µL。

• 通过运行适当方法（表2采用LudgerSep-R1色谱柱进行HPLC分析或表3采用LudgerSep-uR2色谱柱进行UHPLC分析）处理色谱柱，不进样2/3次。然后进样水系统空白，并检查基线是否稳定。如果不是，则保持流水进样直至基线稳定，或在再调节前用10%a和90%B清洗30 min。

• 然后运行2次或更多次SRP唾液酸参比组进样，直至图谱重叠。图谱应类似于图1(HPLC)或图2(UHPLC)。然而，保留时间将根据使用的LC系统而变化。

• LC系统现在可以运行样品组。我们建议按以下顺序（表4）：

表4.样品进样顺序

1. 验收标准
   • 样品集开始和结束时SRP的曲线应重叠，漂移极小

例如：±0.1 min。

• Neu5Gc和Neu5Ac的校准曲线R2值应 > 0.99。
• 根据内部SOP分析的胎球蛋白的Ludger可接受范围为252-377 nmol/mg蛋白（其中，例如34µg胎球蛋白/50U）[参考文献3]。当我们收集更多GCP-FET-50U的内部数据时，对该可接受标准进行了更新。历史可接受范围列于参考文献3中，并附有详细说明。
• 采用内部SOP分析的GPEP-A2G2S2的Ludger可接受范围为5.6-8.4 nmol。

（这是通过定量NMR测定的量±20%）

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00

分钟

图1：在LudgerSep-R1 HPLC色谱柱上运行的DMB标记唾液酸参比组(CM-SRP-01)的色谱图。

峰：1 =  Neu5Gc；  2  =  Neu5Ac；  3  =  Neu5,7Ac2；  4  =  Neu5Gc，9Ac；  5  =  Neu5,8Ac2；  6  =  Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中x是未知的乙酰基位置）；* = 试剂。

注：该色谱图仅作为示例提供。峰宽、分离度和保留时间取决于您实验室的HPLC系统设置。

0.00 1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50

分钟

图2：在LudgerSep-uR2 UHPLC色谱柱上运行的DMB标记唾液酸参比组。

峰：1 =  Neu5Gc；  2  =  Neu5Ac；  3  =  Neu5,7Ac2；  4  =  Neu5Gc，9Ac；  5  =  Neu5,8Ac2；  6  =  Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中x是未知的乙酰基位置）；* = 试剂。

注：该色谱图仅作为示例提供。峰宽、分离度和保留时间取决于您实验室的UHPLC系统设置。

参考文献和相关文献

1. Ludger文件：S-GP-0048-WG-50381-Report-v1.0，DMB标记唾液酸冷冻影响的测定。
2. Ludger文件：唾液酸分析的胎球蛋白质量标准-v2.0.唾液酸分析中胎球蛋白系统适用性标准品可接受标准的确定
3. Ludger文件：DMB-kit-Validation-Report-GP-0057-v1.0，采用Ludger标准对DMB套件进行确认。
4. Ludger文件：关于“定量唾液酸分析”#APN002的应用说明

反应机制

标记反应是一个2步过程。

1. 首先是将闭环（环状）唾液酸平衡为开环（无环）形式。
2. 第二步遵循多步机制，其中DMB染料的伯氨基与α-酮酸的羰基反应形成亚胺，该中间体与溶液中的还原剂反应，从而与染料的其他伯胺反应。重排得到荧光标记的唾液酸（二亚胺）。

故障排除

1. HPLC上的低信号。
   • 酸水解不*：我们建议使用烘箱而不是加热块进行酸水解步骤。一些加热块导致样品瓶盖中的酸蒸发和冷凝，导致酸水解不*。我们还建议使用体积不超过0.5 mL的小样品瓶进行酸水解。
   • 样品中的盐干扰标记：盐和缓冲液可能干扰唾液酸

标记方法。如果怀疑盐干扰样本，分析前在无盐溶剂中透析样本。

1. 色谱图中存在高水平的游离染料峰。
   • 这可能是由过多的光暴露引起的。确保孵育步骤在暗处进行。一旦样品被标记，应立即在LC上运行，以避免降解，因为样品长时间暴露于光照和高温会导致非唾液酸特异性色谱峰增加。该问题也可能是由LC色谱柱随时间的污染引起的，见下文。
   • 当DMB标记样品时，Neu5Ac和Neu5Gc的量显示稳定

如果校准标准品在相同条件下储存并同时进行分析，则在10 ℃下避光储存长达72小时[参考文献3]。如果不可能，则DMB标记的样本可以冷冻长达2天[参考1]。

1. LC色谱峰保留时间的变化；基线不稳定。
   • 错误或旧LC溶剂。始终以相同的方式制备溶剂（使溶剂达到  例如，通过将两种溶剂混合在一起，量筒中的体积为1 l，与单独测量两种溶剂并在瓶中混合不同）。等度梯度对溶剂制备的变化特别敏感。由于蒸发，溶剂组成可能随时间变化。
   • 过量游离染料/肽等污染色谱柱可导致保留时间偏移

和色谱图上的额外峰。对于唾液酸化水平较低的样品（将大量蛋白进样至色谱柱中），这可能更成问题。用正常流动溶剂和乙腈的10:90混合物在正常流速下清洗色谱柱。

• (U)HPLC系统的运行条件尚未优化。一个常见变量

评估您是否使用UHPLC，是“强/弱清洗”。这些可能对色谱产生显著影响。作为一般规则，“弱清洗”使用弱梯度条件，“强清洗”使用强梯度条件。您需要评估其中哪些提供了与产品指南相匹配的SRP跟踪。我们建议通过以下方式开始LC优化  弱洗液。

1. 问题：标签溶液中有沉淀
   • 尽管罕见，但在DMB标记溶液（连二亚硫酸钠、巯基乙醇和DMB染料的混合物）的制备过程中可能会形成轻微沉淀。我们还观察到了这种情况，检测了该混合物的标记效率，并可以证实沉淀物不会影响标记反应。
2. 唾液酸参比组(SRP)(U)HPLC轨迹与指南中的不匹配
   • 确保该参比标准品未进行酸处理。酸处理后，SRP轨迹将仅包含Neu5Ac和Neu5Gc对应的峰。

保证和责任

Ludger保证上述产品符合随附的分析文件。如果产品因误用以外的原因失效，Ludger将根据其选择免费更换或退还购买价格。本保证是排他性的，Ludger不作任何其他明示或暗示保证，包括任何暗示条件或任何特定用途的适销性或适用性保证。

Ludger不对任何附带、后果性或或或或有损失负责。本品仅用于体外研究。