trialtusbioscience CL7 / Im7蛋白纯化体系说明书
CL7 / Im7蛋白纯化系统基于两个小蛋白（CL7和Im7）之间形成的超高亲和力复合物。CL7（16kDa）是与靶蛋白融合的标签，Im7（10 kDa）是与琼脂糖树脂偶联的配体。
CL7的野生型是CE7 DNase，一种有毒的细菌蛋白。突变被设计成消除其DNA结合和DNAse活性，同时保留了对Im7的超高亲和力。
CL7标签可以在靶蛋白的N或C末端表达。我们的质粒提供了溶解度标签，亲和标签和切割位点以及多种克隆选项的组合。
在对照实验中，CL7对溶解度或表达无负面影响。实际上，CL7改善了在无标签的大肠杆菌中表达时原本不溶的蛋白质的表达水平和溶解度。当用CL7标签表达时，几种临床和治疗上相关的蛋白质从不溶部分转移到可溶部分。纯化变性表达的蛋白质不需要变性剂或从包涵体重新折叠。
Im7树脂由CL7的结合伴侣Im7固定在琼脂糖树脂上组成。由于Im7和CL7之间具有高度特异性的亲和力，脱靶树脂的结合极少。具有35-40 mg / mL的高树脂结合能力，可以捕获大量CL7标记的蛋白。Im7结构域具有很高的弹性，使用Gdn-HCl可使树脂再生并重复使用多达100次。
蛋白酶对于从Im7树脂柱上洗脱目标蛋白至关重要。
TriAltus纯化我们自己的SUMO和PSC蛋白酶，由于它们的超高纯度，它们具有很高的活性。TriAltus提供的两种蛋白酶裂解速度都更快，并且比竞争对手的产品便宜。
例如，如果将60-80 mg的蛋白质与5 mL色谱柱结合，则流速为0.2 mL / min的20 mL洗脱缓冲液中的1 mg蛋白酶将仅在1.5-2小时内洗脱蛋白质。少量的蛋白酶是如此稀薄，以至于可能不需要将其去除。但是，如果需要，可以使用用于SUMO的His柱和用于PSC的GST进行抛光步骤。
SUMO蛋白酶用于洗脱N末端标记的蛋白。它是一种高度特异性的酶，可识别SUMO切割位点的三级结构，并且在切割后不留下氨基酸残基。它的特异性也使其裂解速度比PSC快。1 ug SUMO可以在30分钟内裂解2 mg底物96％，在40分钟内裂解99％。
PSC蛋白酶用于切割N或C末端标记的蛋白。它也是高效的：20 ug PSC将在40分钟内以91％的比例裂解2 mg底物，在60分钟内以99％的比例裂解。
CL7和Im7的盐独立性和高度特异性的结合亲和力使其可以实现简单明了的方案。CL7不是在一步中使用His-trap，而是在随后使用特殊标签精制蛋白质，而是在一个色谱步骤中实现了超高纯度。
市场上的每种蛋白质纯化系统都可以通过其在两个参数下的性能来表征：产量和纯度。CL7 / Im7系统在两个方面都优于His-tag和special标签。
TriAltus开发了一种用于高粘合力树脂的高效偶联方法。Im7树脂的结合能力在35-40 mg / mL范围内。这远远优于特殊标签的树脂，以及在用于His-trap的Ni柱的顶端。
纯度取决于蛋白质纯化系统对未标记的细胞成分的敏感性。杂质分为两类：基于标记的靶蛋白/细胞组分相互作用的杂质，以及由于细胞组分与色谱柱结合的配体的非特异性结合而产生的杂质。
在高盐浓度缓冲液的存在下，CL7与Im7的结合不会受到干扰。较高的盐缓冲液可有效地在纯化过程中尽早去除杂质，从而获得干净的最终产品。标签对约0.2-0.3 M的盐浓度敏感，导致一步层析后纯度低。
CL7和Im7彼此高度特定。这样可以防止标签或配体与细胞成分（例如DNA和其他蛋白质）之间发生非特异性相互作用。IMAC系统易与树脂中的金属离子发生非特异性结合。
高耐盐性和高特异性结合这两个因素的结合，可产生如此高的纯度，以至于CL7 / Im7系统仅需一个色谱步骤即可。
ttRNAP（Thermus嗜热菌聚合酶）是一个大的〜400 kDa的蛋白质用5个亚基（α 2 ββ'ω）和4个结合位点。传统上，纯化需要5个连续的色谱步骤才能获得足够高的纯度以实现高活性。蛋白质的纯度与其活性直接相关。将细胞裂解液加载到1.5 M盐缓冲液中是一步纯化的关键。CL7标签附着在最大的 β'亚基上， 不会干扰亚基组装。
Cas9是CRISPR技术的关键组成部分。Cas9活性与其纯度直接相关，但通常需要4-5个色谱步骤才能达到所需的纯度。当Cas9被CL7标记并装载在1.5 M盐缓冲液中时，在一个纯化步骤中可以实现99％的纯度。该酶在体内和体外试验中均显示高活性。
YidC是约32 kDa的细菌膜整合酶。*，膜蛋白难以纯化，因为与细胞成分发生疏水性接触会造成污染。由于His-tag非特异性结合至其色谱柱，因此在纯化的一个步骤后会存在大量杂质。CL7对Im7的特异性将这些影响降至低值，使纯度高达99％。
GCSF，hGH和IFN-α是FDA批准的三种生物制剂。每个都有两个内部半胱氨酸桥，当在没有标签的大肠杆菌中表达时通常不溶。纯化不溶蛋白通常涉及棘手的重折叠步骤，然后是多个色谱步骤。CL7增强了蛋白质的表达，稳定性和折叠性，因此它们不再表达为包涵体。
