rokazyme生产和销售用于研究，诊断和工业测试目的的新型酶。该公司成立于2006年，是冰岛生物技术公司Prokaria的副产品，该公司后来合并为非营利性国有企业Matis。Prokazyme基于二十年的地热生物勘探，微生物基因组学和酶发现。Prokazyme（作为中小企业）与马蒂斯组成了一个研究联盟，并共同参与了由欧盟资助的一些研究项目。持续的研发和与Matis的战略联盟使Prokazyme有机会开发大量不断增长的嗜热细菌和病毒基因数据库，并继续开发新的*酶产品。

Ice and Fire Phosporylation Kit / PNK and Alkaline phosphatase

冰和火磷酸化试剂盒/ PNK和碱性磷酸酶

Ice and Fire™磷酸化试剂盒包括用于核酸5'末端标记的优化试剂。

Ice and Fire™磷酸化试剂盒包括用于核酸5'末端标记的优化试剂。该新方案通过结合不耐热虾碱性磷酸酶（SAP）的低温活性和热稳定的ThermoPhage™多核苷酸激酶（PNK）的高温活性，提供简单的“一步”处理。虾碱性磷酸酶从核酸的5'末端消化单磷酸，二磷酸和三磷酸，留下5'羟基。PNK催化γ磷酸从ATP转移到核酸分子的5'-OH。在简化的温度控制程序中两种酶的组合允许磷酸化核酸的快速和有效的5'末端标记。

可作为50个反应的套件提供。

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产品  ：  IaF170S  | Ice and Fire kit 50反应  | 价格：220.00 EUR

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有关详细信息，请参阅下文或下载说明书

背景：
Ice and Fire Phosphorylation试剂盒为核酸的5'末端标记提供了优化的试剂。简单的方案利用低温和高温来控制不耐热的虾碱性磷酸酶（SAP）和热稳定的ThermoPhage™多核苷酸激酶（PNK）在一种溶液和优化的反应缓冲液（专项技术申请中）中的活性。该试剂盒旨在用末端单磷酸，二磷酸或三磷酸标记DNA或RNA分子的5'末端。其他核酸如PCR产物，寡核苷酸，限制性消化的质粒DNA或复合物样品RNA或DNA也可用该试剂盒标记。基材实际上可以是任何长度。具有5'-磷酸的核酸需要在激酶反应之前去磷酸化。该试剂盒包括虾碱性磷酸酶和热稳定多核苷酸激酶酶混合物。这允许在较低温度下核酸的去磷酸化，然后在加入放射性标记的[γ-32 P] ATP之前加热灭活磷酸酶并通过新型热稳定多核苷酸激酶（1）进行标记。SAP变性和PNK反应在70℃下进行。加热步骤后无法检测到SAP活性，然后进行PNK反应。具有5'-羟基（-OH）基团的核酸也可以使用该试剂盒标记。在这种情况下，磷酸酶通过加热直接灭活，然后加入γ放射性标记的ATP并在70℃温育。SAP变性和PNK反应在70℃下进行。加热步骤后无法检测到SAP活性，然后进行PNK反应。具有5'-羟基（-OH）基团的核酸也可以使用该试剂盒标记。在这种情况下，磷酸酶通过加热直接灭活，然后加入γ放射性标记的ATP并在70℃温育。SAP变性和PNK反应在70℃下进行。加热步骤后无法检测到SAP活性，然后进行PNK反应。具有5'-羟基（-OH）基团的核酸也可以使用该试剂盒标记。在这种情况下，磷酸酶通过加热直接灭活，然后加入γ放射性标记的ATP并在70℃温育。

优点：

磷酸化核酸的有效5'末端标记，单链或双链

酶活性的简单温度控制

在反应之间不需要额外的清除步骤如苯酚/chloroform或旋转柱，仅SAP的热变性

单管格式，简化程序

应用：5' - 磷酸化DNA和RNA的终标记：

核酸酶保护测定

杂交印迹

定量PCR

产品组件：

10X反应缓冲液

SAP / PNK酶混合物

磷酸化的ssDNA寡聚体（10pmol /μL）用作阳性对照

套件未随附的组件：

放射性标记的γ-ATP [32P]

ATP

无核酸酶水

议定书：

核酸5'放射性标记方案：冰与火磷酸化试剂盒提供对照和优化试剂，可快速方便地标记DNA或RNA

1）靶核酸的去磷酸化（SAP反应）：
10x SAP / PNK缓冲液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶DNA / RNA 
10-100pmol无核酸酶水至
24μL在37°C孵育60分钟

2）靶核酸的磷酸化（PNK反应）：
在37℃温育后，将样品加热至70℃。在70℃下15分钟后，向反应中加入XμL放射性标记的[γ-32 P] ATP，相当于待标记末端的2-5摩尔过量ATP（例如使用7,000 Ci / mmol，150 mCi / ml [γ] -32 P] ATP，1μL约为25 pmol）。在70°C孵育另外30-60分钟。冷却至+ 4°C或置于冰上以阻止反应。

任选：加入1mM EDTA和/或在95℃加热反应5分钟以终止反应。

任选：通过旋转柱（例如Qiagen核苷酸去除试剂盒，目录号28304或等效的旋转柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝胶纯化来清洁探针。（2）。

放射性标记的核酸现在可以使用了

第二议定书：

用于5'标记5'羟基化核酸的方案：Prokazyme Ltd也提供ThermoPhage TM PNK用于标记5'羟基化核酸，但Ice and Fire磷酸化试剂盒也可用于此类应用。

1）反应混合物
10x SAP / PNK缓冲液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶DNA / RNA 
10-100pmol无核酸酶水至
24μL在70℃孵育15分钟以灭活SAP酶。

2）靶核酸的多核苷酸激酶5'标记：
将XμL放射性标记的[γ-32 P] ATP加入到相当于2-5摩尔过量ATP的反应中，待标记的末端（例如使用7,000 Ci / mmol，150 mCi） / ml [γ-32 P] ATP，1μL约为25pmol）。
在70°C孵育60分钟。冷却至+ 4°C或置于冰上以阻止反应。

任选：加入1mM EDTA和/或在95℃加热反应5分钟以终止反应。

任选：通过旋转柱（例如Qiagen核苷酸去除试剂盒，目录号28304或等效的旋转柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝胶纯化来清洁探针。（2）。

放射性标记的核酸现在可以使用了

方案III：

没有放射性ATP的磷酸化：该试剂盒也可用于在克隆程序等之前磷酸化5'羟基化核酸。

1）反应混合物
10x SAP / PNK缓冲液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶DNA / RNA 1-500pmol无
核酸酶水至
24μL在70℃孵育15分钟以灭活SAP酶。

2）靶核酸的多核苷酸激酶5'磷酸化：
将ATP加入到反应中至终浓度为10-100μM（至少两倍于核酸末端的磷酸化浓度）。
在70°C孵育60分钟。冷却至+ 4°C或置于冰上以阻止反应。

任选：通过旋转柱（例如Qiagen核苷酸去除试剂盒，目录号28304或等效的旋转柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝胶纯化来清洁探针。（2）。

现在核酸已准备好用于克隆程序

评估协议：

如果需要确定特定放射性或如果研究人员想要评估反应效率，则可以使用以下评估方案。请注意，此评估需要闪烁计数器，闪烁液和DE81过滤器或等效仪器和组件。将1μL反应物稀释至1/10并将1μL点稀释至Whatman Inc.DE81过滤器（目录号3658023）或其等同物。作为阳性对照，将相同的量放在一个不经过洗涤步骤的过滤器上。没有酶混合物的反应溶液可用作阴性对照并用样品洗涤。将样品和阴性对照滤膜在400ml磷酸钠缓冲液pH7中洗涤两次30分钟，干燥并放入闪烁计数瓶中，加入闪烁液并在液体闪烁计数器中计数放射性。为了确定标记的核酸的比活性，计算掺入反应中的总cpm并将其除以pmol中标记的核酸的量。

（#total cpm合并*稀释因子*体积）/（#total pmol核酸）

预期的比活性：
当具有7000 Ci / mmol的比活性的[γ-32P] ATP用于激酶反应时，核酸应在参考日期标记至至少1×10 6 cpm / pmol。在放射性标记的ATP小瓶上标明的参考日32P的衰变可以计算为:(原始cpm /μl）/（2（天/ 14.3））

参考文献：

Blondal，T.，Hjorleifsdottir，S.，Aevarsson，A.，Fridjonsson，OH，Skirnisdottir，S.，Wheat，JO，Hermannsdottir，AG，Hreggvidsson，GO，Smith，AV and Kristjansson，JK（2005）J Biol Chem， 280,5188-5194。

Sambrook，J.，Fritsch，EF和T.，M。（1989）Molecular cloning，a laboratory manual。冷泉港实验室，纽约冷泉港。

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