预期用途

Eagle Biosciences MMAE（单甲基澳瑞他汀E）抗体药物偶联物(ADC)ELISA检测试剂盒（酶联免疫分析试剂盒）预期用于定量测定供试品中的抗体-MMAE-偶联物水平。可用于MMAE抗体药物偶联物(ADC)的临床前和临床药理学研究。

• 来自组织/细胞培养物的样本和来自人、大鼠、小鼠、灵长类动物等的血清样本。可直接与本试剂盒配合使用。
• 基于人源化单克隆抗体的MMAE-ADC和基于小鼠单克隆抗体的MMAE-ADC均可用本试剂盒测定。

试验原理

Eagle Biosciences MMAE抗体药物偶联物(ADC)ELISA检测试剂盒的设计、开发和生产用于定量测定血清中的抗体一甲基澳瑞他汀E(MMAE)偶联物。该测定法采用竞争性免疫分析技术，抗体仅与一甲基auristatin E结合。

将分析校准品（抗体MMAE偶联物）和供试血清样本直接加入包被有特异性抗MMAE抗体的微量滴定板的孔中。随后，向每个孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)结合的MMAE。在孵育期间，抗体MMAE偶联物与HRP结合的MMAE竞争抗MMAE抗体的有限结合位点。包被良好的“抗MMAE抗体”免疫复合物

• 形成“HRP偶联MMAE”。在随后的洗涤步骤中除去未结合的抗体和缓冲液基质。为检测该免疫复合物，将微孔与底物溶液在定时反应中孵育，并用酸性试剂（即ELISA终止液）终止反应。然后在分光光度酶标仪中测定吸光度。与每个微量滴定孔壁结合的免疫复合物的酶活性与供试品中抗体-MMAE结合物的量成反比。通过在4参数或对数-对数曲线拟合上绘制每个校准品的吸光度与各自抗体-MMAE偶联物浓度的曲线，生成校准曲线。根据校准曲线直接测定供试品中抗体-MMAE偶联物的浓度。

试剂：制备和储存

接收后，该人MMAE抗体药物偶联物(ADC)ELISA检测试剂盒必须在2-8 ℃下储存。关于试剂盒的失效日期，请参阅试剂盒包装盒上的标签。所有组分在失效日期前均保持稳定。

使用前使所有试剂恢复至室温。不同试剂盒批号的试剂不得合并或互换。

1. 抗-MMAE抗体包被微孔板（产品目录号编号30748）

一个微孔板上有12 × 8个条带（共96孔），包被有特异性抗MMAE抗体。将板框定并密封在含有干燥剂的箔拉链袋中。该试剂应在2-8 ℃下储存，并在试剂盒包装盒上的失效日期前保持稳定。

2. HRP结合的MMAE（货号编号30685）

一个小瓶含有3 mL即用型HRP标记的MMAE，溶于稳定的蛋白基质中。该试剂应在2-8 ℃下储存，并在试剂盒包装盒上的失效日期前保持稳定。

3ELISA清洗浓缩液（产品目录号编号10010）

1瓶含30 mL 30倍浓缩液。使用前，必须用870 mL去离子水稀释内容物并混匀。稀释后，得到含有表面活性剂的工作清洗液，溶于磷酸盐缓冲盐水中，其中含有非叠氮化物、非汞防腐剂。稀释的清洗液可在室温下储存，并在试剂盒包装盒上标注的失效日期前保持稳定。

4. ELISA HRP底物（货号编号10020）

一瓶含15 mL四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢。该试剂应在2-8 ℃下储存，并在试剂盒包装盒上的失效日期前保持稳定。

5. ELISA终止液（货号编号10030）

一瓶含15 mL终止液。本试剂可在2-8 ℃或室温下储存，在试剂盒包装盒上标注的失效日期前可保持稳定。

6. 抗体-MMAE偶联零校准品（货号编号30711）

一个装有30 mL零校准品(30711)的小瓶。该试剂用于稀释测定校准品的校准储备液以及稀释供试品。本试剂应在2-8 ℃下储存，在试剂盒包装盒上标注的失效日期前可保持稳定。

7. 抗体-MMAE偶联校准储备液（货号编号30712）

（试剂盒中未提供-可选）

一瓶(30712)含有抗体-MMAE-偶联物的校准储备液，溶于含非叠氮化物防腐剂的冻干(0.5 mL)血清基质中。标准品的准确浓度参见小瓶。该试剂应在2-8 ℃下储存，并在试剂盒包装盒上的失效日期前保持稳定。

安全注意事项

人MMAE抗体药物偶联物(ADC)检测试剂盒试剂必须在专业实验室环境中使用，仅供研究使用，不得用于诊断程序。仅牛血清试剂来源的原材料来自美国连续48个国家。仅从兽医监督下饲养的供体健康动物中获得，发现无传染病。进行本试验时佩戴手套，并将这些试剂视为具有潜在传染性进行处理。避免接触含有TMB、过氧化氢或硫酸的试剂。TMB可能会刺激皮肤和粘膜，引起皮肤过敏反应。TMB是一种疑似致癌物。硫酸接触皮肤可能引起严重刺激。请勿接触眼睛、皮肤或衣服。请勿摄入或吸入烟雾。接触后，用大量水冲洗至少15 min。使用药物非临床研究质量管理规范。

需要但未提供的材料

• 抗体-MMAE偶联校准储备液（货号编号30712）
• 能够递送25µL、50µL和100µL等体积的精密单通道移液器。
• 重复适用于递送100µL的分配器。
• 适用于上述体积分配的一次性移液器吸头。
• 一次性12 x 75 mm或13 x 100玻璃管或塑料管。
• 带盖的一次性100 mL和1000 mL塑料瓶。
• 铝箔。
• 去离子水或蒸馏水。 

• 塑料微量滴定孔盖或聚乙烯膜。
• ELISA多通道洗瓶或全自动（半自动）洗涤系统。
• 能够读取450/650 nm或450/620 nm处吸光度的分光光度酶标仪。

试剂制备

1. 使用前，使所有试剂恢复至室温。不同试剂盒批号的试剂不得组合或互换。
2. 使用前，必须将ELISA清洗浓缩液稀释至工作溶液。详细信息请参见试剂章节。
3. 用0.5 mL去离子水复溶校准储备液30712。使用零校准品(30711)以1:X*稀释复溶校准储备液(30712)，以获得浓度为4µg/mL的水平9校准品。通过1:2连续稀释进一步创建校准品水平八至二，以获得浓度为2µg/mL、1µg/mL、0.5µg/mL、0.25µg/mL的校准品。

0.125µg/mL、0.063µg/mL和0.032µg/mL。测定校准品应在2小时内使用，并应储存在-20 ℃以下。冻融循环次数不得超过3次。

1:X* 1:2 1:2 1:2 1:2 ……

X* = 30712/4的浓度

4. 测试配置

使用抗体-MMAE偶联储备液（产品目录号编号30712）。为了订购该校准品储备液，请订购Ab-MMAE结合储备液（货号编号30712）。

试验程序

1. 将足够数量的抗MMAE抗体包被微孔板条/孔置于支架上，以一式两份运行人抗MMAE标准品、对照品和未知样品。
2. 向微孔中加入100µL校准品和供试品。
3. 牢固密封板孔，用箔或其他材料遮光，在ELISA板振荡器（小轨道半径）上以400～450 rpm转速旋转30 min。
4. 立即向每个孔中加入25 μL HRP标记MMAE（目录号30719）。（注：在加入HRP标记的MMAE之前无需进行洗涤步骤）
5. 牢固密封板孔，用箔或其他材料遮光，并在ELISA板振荡器（小轨道半径）上以400至450 rpm转速旋转2 h±10 min。
6. 向各孔中加入350µL工作清洗液，清洗各孔5次，然后*吸出内容物。或者，可以使用自动微孔板洗板机。
7. 向各孔中加入100µL ELISA HRP底物。
8. 用铝箔或其他材料覆盖微孔板，避免暴露于光照下。将平板在室温下静置孵育20 min。
9. 立即向每个孔中加入100µL ELISA终止液。轻轻混合。
10. 读取450 nm处的吸光度。

程序注释

1. 建议所有校准品和未知样本重复测定两次。每份重复样本的平均吸光度读数应用于数据简化和结果计算。建议在每次检测中添加外部质控品。
2. 将光敏试剂保存在原始琥珀色瓶中。
3. 将任何未使用的抗体包被条储存在含有干燥剂的箔拉链袋中，以防止受潮。
4. 为确保试验的重现性，必须采用仔细的技术并使用适当校准的移液装置。
5. 除本说明书中规定的孵育时间或温度外，其他孵育时间或温度可能影响结果。
6. 可使用轨道半径较大（例如 > 1 cm）的轨道混合器，转速为150-200 rpm。
7. 避免微孔中出现气泡，因为这可能导致较低的结合效率和较高的重复读数CV%。
8. 使用前，应轻轻充分混合所有试剂。避免起泡。
9. 如果该测定适用于自动ELISA系统，如DS-2、DSX或Trituras，如果测定程序有任何修改，则需要进行程序验证。

结果判读

建议使用4参数或log-logit校准曲线拟合。

1. 计算每对重复检测结果的平均吸光度。
2. 通过纵坐标上所有校准品水平的校正吸光度与校准品浓度生成校准曲线。应使用适当的计算机辅助数据简化程序进行结果计算。

使用各自的校正吸光度，从校准曲线中直接读取供试品的抗体-MMAE偶联物浓度。

示例数据和标准曲线

给出了人MMAE抗体药物偶联物(ADC)ELISA检测试剂盒的典型吸光度数据和所得标准曲线。不得使用该曲线代替每次试验的标准曲线运行。

程序的局限性

1. 本试验需要血清或血浆样本进行检测。
2. 不同种属的血清或血浆样本可能显示不同的基质背景。可能需要修改试验程序以测量啮齿类动物样本。
3. 对于大于4µg/mL的样本值，建议使用稀释液（即，使用零校准品基质的1:10或1:100稀释液）重新测定样本。该校准品零可从试剂盒制造商处获得。由于基质效应，使用不同的缓冲液基质进行样本稀释可能会导致假高或假低值。）。分析精密度和检测结果位于标准曲线的15%B/B0至90%B/B0之间。
4. 细胞培养或组织培养样品在使用前应进行总结合率和其他性能标准的验证。
5. 试剂盒校准品基于MMAE结合抗体或ADC浓度。它不是基于游离MMAE浓度。不同连接体和DAR中的MMAE-ADC可能产生不同的曲线偏移。

质量控制

为确保结果的有效性，每次测定均应包括适当的质控品。

性能特征

灵敏度

该MMAE ADC EIA的分析灵敏度(LLOD)约为0.0435µg/mL，通过8次零标准品(B0)重复测定的B0平均值以下的2倍标准偏差确定。

特异性

该MMAE-ADC EIA未显示与MMAF-ADC、DM1-ADC和DUO-6-ADC的任何交叉反应性。

高剂量“钩状”效应

该试验表明，高达1,000µg/mL的MMAE ADC水平没有任何高剂量“钩状”效应。

精密度

通过测量3个校准品（L3、L6和L8）的8次重复测定验证批内精密度。CV%为7.1%、6.7%和11.0%。

使用零校准品基质稀释两份样本并进行检测。MMAE ADC稀释回收率值结果如下：

加标回收率

将校准品水平4和6与校准品水平3、5和7等体积混合并检测。结果如下：

1. 100µl校准品和未知样本

在ELISA板振荡器上室温下孵育30 min

2. 25µl MMAE示踪剂

在ELISA板振荡器上室温下孵育2小时洗涤5次