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原核表达载体现货供应

描述:启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达*的重要调控序列。没有启动子,基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。

更新时间:2016-12-06
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详情介绍

 原核表达载体指:能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。

 
  

 

 

编辑本段原核表达载体调控原件

1.启动子

  启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达*的重要调控序列。没有启动子,基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区。来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使*和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA链。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。

2. SD序列

  1974年Shine和Dalgarno首先发现,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3~9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列,简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一,某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合,从而影响蛋白质的翻译。另外,真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后,才能产生一个完整的蛋白质。

3.终止子

  在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列,且具有终止转录功能,这一序列称之为转录终止子,简称终止子(terminator)。转录终止过程包括:RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进,RNA的延伸也停止在终止信号上,完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点,即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域,G/C富含区域又具有回文对称结构。这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构,并且有与A/T富含区对应的一串U。转录终止的机制较为复杂,并且结论尚不统一。但在构建表达载体时,为了稳定载体系统,防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性,一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。

 

编辑本段原核表达载体构建

1.获得目的基因

  (1)通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

 

  (2)通过RT-PCR方法:提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA*链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

2.构建重组表达载体

  (1)载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

 

  (2)PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

3. 获得含重组表达质粒的表达菌种

  (1) 将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。

 

  (2)测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

 

  (3) 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

  

 

 
 

 

1. pET系列载体
1. pET系列载体
78-pet-5apET-5a2ug
78-pet11apET11a2ug
78-pet-11bpET-11b2ug
78-pet-11cpET-11c2ug
78-pet-15bpET-15b2ug
78-pet-16b(+)pET-16b(+)2ug
78-pet17bpET17b2ug
78-pet-19bpET-19b2ug
78-pet-20b(+)pET-20b(+)2ug
78-pet21a(+)pET21a(+)2ug
78-pet-21bpET-21b2ug
78-pet-21d(+)pET-21d(+)2ug
78-pet-22bpET-22b2ug
78-pet-23a(+)pET-23a(+)2ug
78-pet-24pET-242ug
78-pet24a(+)pET24a(+)2ug
78-pet24-bpET24-b2ug
78-pet-25b(+)pET-25b(+)2ug
78-pet26bpET26b2ug
78-pet27-bpET27-b2ug
78-pet-28apET-28a2ug
78-pet-28bpET-28b2ug
78-pet-28cpET-28c2ug
78-pet29apET29a2ug
78-pet-29bpET-29b2ug
78-pet-30apET-30a2ug
78-pet-30bpET-30b2ug
78-pet-30cpET-30c2ug
78-pet-32apET-32a2ug
78-pet32(+)cpET32(+)c2ug
78-pet-32bPET-32b2ug
78-pet35b(+)pET35b(+)2ug
78-pet38b(+)pET38b(+)2ug
78-pet-39bpET-39b2ug
78-pet-3apET-3a2ug
78-pet-40b(+)pET-40b(+)2ug
78-pet-41apET-41a2ug
78-pet-42a(+)pET-42a(+)2ug
78-pet-42bpET-42b2ug
78-pet-43apET-43a2ug
78-pet-43bpET-43b2ug
78-pet-49b(+)pET-49b(+)2ug
78-PET-31b(+)ET31b(+)2ug
78-pet-41b(+)pET-41b(+)2ug
78-pet41Ek-LicpET41Ek-Lic2ug
2. PTYB 系列载体2. PTYB 系列载体
78-TYB1TYB12ug
78-TYB2TYB22ug
78-TYB11TYB112ug
78-TYB12TYB122ug
3. pGEX系列载体3. pGEX系列载体
78-pGEX-4T-1pGEX-4T-12ug
78-pGEX-4T-2pGEX-4T-22ug
78-pGEX-6P-1pGEX-6P-12ug
78-pGEX-20TpGEX-20T2ug
78-pGEX-4T-3pGEX-4T-32ug
78-pGEX-6P-2pGEX-6P-22ug
78-pGEX-5X-1pGEX-5X-12ug
78-pGEX-2TKpGEX-2TK2ug
78-pGEXpGEX2ug
78-pGEX-KGpGEX-KG2ug
4. pBAD系列载体4. pBAD系列载体
78-pBAD24pBAD242ug
78-pBAD43pBAD432ug
78-pBADHis ApBADHis A2ug
78-pBADHisBpBADHisB2ug
78-pBADHisCpBADHisC2ug
5.原核融合表达载体5.原核融合表达载体
78-PProEX-HTapProEX-HTa2ug
78-PProEX-HTbpProEX-HTb2ug
78-PProEX-HTcpProEX-HTc2ug
78-PMAL-c4xpMAL-c4x2ug
78-PEYFP-mempEYFP-mem2ug
78-PEXP1-DESTpEXP1-DEST2ug
6. 其他载体
78-Pbv220pbv2202ug
78-PET-DsbApET-DsbA2ug
78-PET-GSTpET-GST2ug
78-PET-HispET-His2ug
78-KD3KD32ug
78-PLLP-Om78-PApLLP-OmpA2ug
78-PLLP-STIIpLLP-STII2ug
78-PMAL-C2XpMAL-C2X2ug
78-PMAL-P2XpMAL-P2X2ug
78-PMBP-PpMBP-P2ug
78-PQE30pQE302ug
78-PQE31pQE312ug
78-PQE-32pQE-322ug
78-PRSET CpRSET C2ug
78-PRSET-A/BpRSET-A/B2ug
78-PTH-304-18ZpTH-304-18Z2ug
78-PTrcHis BpTrcHis B2ug
78-PTrcHis CpTrcHis C2ug
78-PTrcHisApTrcHisA2ug
78-PTrxFuspTrxFus2ug
78-PTWIN1pTWIN12ug
78-PG-KJE8pG-KJE82ug
78-PGro7pGro72ug
78-PKJE7pKJE72ug
78-PG-Tf2pG-Tf22ug
78-PTf16pTf162ug
78-PQE40pQE402ug
78-PCMV-mycpCMV-myc2ug
78-PQE80pQE802ug
78-PSE380pSE3802ug
78-PQE-9pQE-92ug
78-PQE-60pQE-602ug
78-PQE-70pQE-702ug
78-PTWIN2pTWIN22ug
78-PCFS119PCFS1192ug
78-PVSV-GpVSV-G2ug
78-PCDFDuet-1pCDFDuet-12ug
78-PSecTag2 HygroApSecTag2 HygroA2ug

 

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